人熱休克蛋白70定量分析酶聯免疫檢測試劑盒

本試劑盒僅供科研使用 。用於體外定量檢測人血清 、血漿中的熱休克蛋白70原濃度 。使用前請仔細閱讀說明書並檢查試劑組分是否完整 。如有產品包裝破損或質量投拆 ，請在收到貨一個月之內聯係尊龍凱時 。

熱休克蛋白70原簡介 ：

熱休克蛋白70（HSP70） ，也叫做熱休克蛋白1A (HSPA1A) 。是一個屬於保護性熱休克蛋白70家族的一員 ，分子量約70千道爾頓 。HSP70在各類細胞中都是豐富表達的保守蛋白 。HSP70蛋白的N端具有核苷酸結合且具ATP酶活性的結構 ，C端底物結合結構域 。人的HSP70與小鼠和大鼠的蛋白序列分別有95%和97%的同源性 。

Hsp70的核苷酸及底物結合結構協同起作用達到保護新生蛋白正確折疊 ，幫助折疊錯誤的蛋白或無功能重新正確折疊成有功能的蛋白 。HSP70能協助蛋白通過細胞膜 ，阻止蛋白的過度聚集，能協助過氧化物酶對錯誤的蛋白進行降解 。在病理學方麵 ，許多種的腫瘤中都觀察到HSP70的增加 。在一些神經組退化的病症中 ，也因協助錯誤折疊蛋白的再折疊而引起HSP70的積累 ，而觀察到HSP70的大量升高 。

檢測原理:

本試劑盒采用雙抗體夾心ELISA法檢測樣本中熱休克蛋白70的濃度 。熱休克蛋白70捕獲抗體已預包被於酶標板上 ，當加入標本或參考品時 ，其中的熱休克蛋白70會與捕獲抗體結合 ，其它遊離的成分通過洗滌的過程被除去 。當加入辣根過氧化物酶標記的抗人熱休克蛋白70抗體後 ，抗人熱休克蛋白70抗體與熱休克蛋白70接合 ，形成夾心的免疫複合物 ，其它遊離的成分通過洗滌的過程被除去 。最後加入顯色劑 ，若樣本中存在熱休克蛋白70將會形成免疫複合物 ，辣根過氧化物酶會催化無色的顯色劑氧化成藍色物質 ，在加入終止液後呈黃色 。通過酶標儀檢測 ，讀其450nm處的OD值 ，熱休克蛋白70濃度與OD₄₅₀值之間呈正比 ，通過參考品繪製標準曲線 ，對照未知樣本中OD值 ，即可算出標本中熱休克蛋白70濃度 。

人熱休克蛋白70定量分析酶聯免疫檢測試劑盒組成:

標本收集:

1.標本的收集請按下列流程進行操作 ；

A.細胞上清標本離心去除懸浮物後即可 ；

B.血清標本應是自然凝固後 ，取上清，避免在冰箱中凝固血液 ；

C.血漿標本 ，推薦用EDTA的方法收集若待測樣本不能及時檢測 ，

D.標本收集後請分裝 ，凍存於－20℃ ，避免反複凍融 。

2.血清標本不應添加任何防腐劑或抗凝劑 ；

3.標本應清澈透明 ，檢測前樣本中如有懸浮物應通過離心去除 。

4.請勿使用溶血，高血脂或汙染的標本檢測 ，否則結果將不準確 。

注意事項:

1.試劑盒請保存在2～8℃ 。

2.濃縮洗滌液因在低溫下可能有結晶 ，請水浴加熱使結晶完全溶解後再配製工作液 。

3.標準品複溶加樣後 ，剩餘部份請丟棄 。

4.底物請勿接觸氧化劑和金屬 。

5.加樣時 ，請及時更換槍頭 ，避免交叉汙染 。

6.嚴禁混用不同批號的試劑盒組份 。

7.充分混勻對保證反應結果的準性很重要 ，在加液後請輕輕叩擊邊緣以保證混勻 。

8.室溫反應 ，請嚴格控製在25～28℃ 。

9.洗滌過程是至關重要的 ，洗滌不充分會使精確度下降並導致結果誤差較大 。

10.試驗中標準品和樣本檢測時建議作雙複孔 。

11.加樣過程中避免氣泡的產生 。

檢測前準備工作: 

1.試劑盒自冰箱中取出後應置室溫（25～28℃）平衡20分鍾 ；每次檢測後剩餘試劑請及時於2～8℃保存 。

2.將濃縮洗滌液用雙蒸水或去離子水稀釋(1份加19份水) 。

3. 將檢測抗體用檢測抗體稀釋液按標識提前10分鍾配製成工作濃度 ；

3.如有5X準品稀釋液 ，請按所需量用雙蒸水或去離子水稀釋(1份加4水) 。

4.標準品: 按標簽複溶體積加入標準品稀釋液複溶使熱休克蛋白70終濃度達到1000ng/ml ，室溫反應 ，請嚴格控製在25～28℃ ，靜置10~15分鍾後輕輕混懸（建議抽吸幾次）待徹底溶解 ，用標準品稀釋液倍比梯度稀釋後依次加入檢測孔中 。（標準曲線取七個點 ，最高濃度為1000ng/ml,標準品稀釋液直接加入作為0濃度.）下圖為標準品稀釋示意圖 。

洗滌方法:

自動洗板機或人工洗板 ：每孔洗滌液為300ul ，注入與吸出間隔15-30秒 。洗板5次 。最後一次洗板完成後將板倒扣著在厚吸水紙上用力拍幹 。

實驗過程需自備的材料 ：

1.不同規格的加樣槍及相應的槍頭 ；   

2.酶標儀 ；

3.自動洗板機 ；                     

4.去離子水或雙蒸水 ；

操作步驟:

1.通過計算並確定一次性實驗所需的板條數 ，取出所需板條放置在框架內 ，暫時用不到板條請放回鋁箔袋密封 ，保存於4℃ 。

2.建議設置本底較正孔 ，即空白孔,設置方法為該孔隻加TMB顯色液和中止液 。每次實驗均需做標準品對照並畫出標準曲線 。

3.分別將稀釋好的標本或不同濃度標準品(100ul/孔)加入相應孔中 ，用封板膠紙封住反應孔 ，37℃孵育120分鍾 。    

4.洗板5次 ，且最後一次置厚吸水紙上拍幹 。

5.每孔加入HRP抗體結合物工作液(100ul/孔) 。用封板膠紙封住反應孔 ，37℃孵育孵育60分鍾 。    

6.洗板5次 ，且最後一次置厚吸水紙上拍幹 。

7. 加入顯色劑TMB100ul/孔 ，避光室溫（25～28℃）孵育20分鍾 。

8. 加入終止液50ul/孔,混勻後即刻測量OD₄₅₀值 。

結果判斷:

1.複孔的值在20%的差異範圍內結果才有效 ，複孔的值平均後可作為測量值 。

2.每個標準品或標本的OD值應減去本底校正孔的OD值 。

3.手工繪製標準曲線 。以標準品濃度作橫坐標 ，OD值作縱坐標，以平滑線連接各標準品的坐標點 。通過標本的OD值可在標準曲線上查出其濃度 。

4.若標本OD值高於標準曲線上限 ，應適當稀釋後重測 ，計算濃度時應乘以稀釋倍數

典型數值和參考曲線

人熱休克蛋白70參考標準曲線

注意 ：本圖僅供參考 ，應以同次試驗標準品所繪標準曲線計算標本含量 。

靈敏度 ，特異性和重複性:

1.靈敏度 ：多次重複結果表明 ，最小檢出量為7.2ng/ml 。

2.特異性 ：與人的GRP-78 、HSPA2 、HSPA6 、HSPA8等沒有交叉反應 。

3.重複性 ：板內 ，板間變異係數均<10%.

參考文獻:

1. Gaudio, E. et al. (2013) Blood 121:351.

2. Liu, M. et al. (2008) J. Biol. Chem. 283:35783.

3. Cho, H.S. et al. (2012) Nat. Commun. 3:1072.

4. Wang, A.M. et al. (2013) Nat. Chem. Biol. 9:112.

5. Wu, F.H. et al. (2012) Cancer Lett. 317:157.

6. McDonough, H. & C. Patterson (2003) Cell Stress Chaperones 8:303.