人C反應蛋白（超敏）定量分析酶聯免疫檢測試劑盒

本試劑盒僅供科研使用 。用於體外定量檢測人血清 、血漿或細胞培養上清液中的CRP濃度 。使用前請仔細閱讀說明書並檢查試劑組分是否完整 。如有產品包裝破損或質量投拆 ，請在收到貨一個月之內聯係尊龍凱時 。

CRP簡介 ：

C反應蛋白（CRP）是人體內的急性反應蛋白 ，在人體免疫防禦反應中重要的介導物 ，屬於穿透素家族的蛋白 。CRP蛋白的前體蛋白是224殘基的蛋白 ，成熟的CRP有206個搭氨基酸殘基 ，通過非共價結合的方式形成五聚體的環狀結構 。

無論是感染還是非感染性的炎症 、組織壞死和惡性腫瘤時 ，人體血液中的CRP蛋白濃度都會急劇升高 。在感染 ，炎症反應及組織壞死中 ，人血清中的CRP蛋白在24~48小時內可急劇升高到正常水平的1000倍 。

在許多種細菌和真菌表麵的膽堿磷酸是CRP蛋白的配體 ，CRP與配體的結合是依賴Ca2+的 。CRP也可與受傷細胞的膜 、壞死的胞核和調亡的細胞等結合 。一旦與受體結合 ，CRP蛋白就會啟動C1q ，從而引起一係列的級聯反應 。CRP蛋白也會與吞噬細胞的表麵Fcγ RI和Fcγ RII結合 ，從而啟動吞噬細胞的吞噬反應 。

CRP主要在肝內產生，IL-6是肝實質細胞產生CRP蛋白的主要介導物 ，此外IL-1和糖皮質激素也是CRP蛋白產生重要的誘導物 。

檢測原理:

本試劑盒采用雙抗體夾心ELISA法檢測樣本中CRP的濃度 。CRP捕獲抗體已預包被於酶標板上 ，當加入標本或參考品時 ，其中的CRP會與捕獲抗體結合 ，其它遊離的成分通過洗滌的過程被除去 。當加入與生物素化的抗人CRP抗體後 ，抗人CRP抗體與CRP接合 ，形成夾心的免疫複合物 ，其它遊離的成分通過洗滌的過程被除去 。再加入親和素連接的HRP結合物 ，生物素與親和素結合 ，其它遊離成分通過洗滌的過程被除去 ，最後加入顯色劑 ，若樣本中存在CRP將會形成免疫複合物 ，辣根過氧化物酶會催化無色的顯色劑氧化成藍色物質 ，在加入終止液後呈黃色 。通過酶標儀檢測 ，讀其450nm處的OD值 ，CRP濃度與OD₄₅₀值之間呈正比 ，通過參考品繪製標準曲線 ，對照未知樣本中OD值 ，即可算出標本中CRP濃度 。

人高敏CRP定量分析酶聯免疫檢測試劑盒組成:

標本收集:

1.標本的收集請按下列流程進行操作 ；

A.細胞上清標本離心去除懸浮物後即可 ；

B.血清標本應是自然凝固後 ，取上清 ，避免在冰箱中凝固血液 ；

C.血漿標本 ，推薦用EDTA的方法收集若待測樣本不能及時檢測 ，

D.標本收集後請分裝 ，凍存於－20℃ ，避免反複凍融 。

2.血清標本不應添加任何防腐劑或抗凝劑 ；

3.標本應清澈透明 ，檢測前樣本中如有懸浮物應通過離心去除 。

4.請勿使用溶血 ，高血脂或汙染的標本檢測 ，否則結果將不準確 。

注 ：人血清或血漿樣本請用標準品稀釋液做稀釋後再檢測 ，稀釋比例為200-4500倍 。

注意事項:

1.試劑盒請保存在2～8℃ 。

2.濃縮洗滌液因在低溫下可能有結晶 ，請水浴加熱使結晶完全溶解後再配製工作液 。

3.標準品複溶加樣後 ，剩餘部分請丟棄。

4.底物請勿接觸氧化劑和金屬 。

5.加樣時 ，請及時更換槍頭 ，避免交叉汙染 。

6.嚴禁混用不同批號的試劑盒組份 。

7.充分混勻對保證反應結果的準性很重要，在加液後請輕輕叩擊邊緣以保證混勻 。

8.室溫反應 ，請嚴格控製在25～28℃ 。

9.洗滌過程是至關重要的 ，洗滌不充分會使精確度下降並導致結果誤差較大 。

10.試驗中標準品和樣本檢測時建議作雙複孔 。

11.加樣過程中避免氣泡的產生 。

12.血清和血漿標本的檢測時 ，檢測抗體的孵育時間應適當延長 。

檢測前準備工作: 

1.試劑盒自冰箱中取出後應置室溫（25～28℃）平衡20分鍾 ；每次檢測後剩餘試劑請及時於2～8℃保存 。

2.將濃縮洗滌液用雙蒸水或去離子水稀釋(1份加19份水) 。

3.如有5X準品稀釋液 ，請按所需量用雙蒸水或去離子水稀釋(1份加4水) 。

4.標準品: 按標簽複溶體積加入標準品稀釋液複溶使CRP終濃度達到10000pg/ml，室溫反應 ，請嚴格控製在25～28℃ ，靜置10~15分鍾後輕輕混懸（建議抽吸幾次）待徹底溶解 ，用標準品稀釋液倍比梯度稀釋後依次加入檢測孔中 。（標準曲線取七個點 ，最高濃度為10000pg/ml,標準品稀釋液直接加入作為0濃度.）

洗滌方法:

自動洗板機或人工洗板 ：每孔洗滌液為300ul ，注入與吸出間隔15-30秒 。洗板5次 。最後一次洗板完成後將板倒扣著在厚吸水紙上用力拍幹 。

實驗過程需自備的材料 ：

1.不同規格的加樣槍及相應的槍頭 ；   

2.酶標儀 ；

3.自動洗板機 ；                     

4.去離子水或雙蒸水 ；

操作步驟:

1.通過計算並確定一次性實驗所需的板條數 ，取出所需板條放置在框架內 ，暫時用不到板條請放回鋁箔袋密封 ，保存於4℃ 。

2.建議設置本底較正孔 ，即空白孔,設置方法為該孔隻加TMB顯色液和中止液 。每次實驗均需做標準品對照並畫出標準曲線 。

3.分別將標本或不同濃度標準品(100ul/孔)加入相應孔中 ，用封板膠紙封住反應孔 ，室溫（25～28℃）孵育120分鍾 。如果是血清血漿樣本 ，不同樣本稀釋比例不一樣 ，一般範圍在20~450倍 ，如無明確範圍 ，建議從100倍稀釋 ，如果樣本濃度過高，超過檢測範圍 ，請加大稀釋倍數後重新稀釋檢測 。

4.洗板5次 ，且最後一次置厚吸水紙上拍幹 。

5.加入生物素連接抗體工作液(100ul/孔) 。用封板膠紙封住反應孔 ，室溫（25～28℃）孵育60分鍾 。    

6.洗板5次 ，且最後一次置厚吸水紙上拍幹 。

7. 加入親和素連接HRP工作液(100ul/孔) 。用封板膠紙封住反應孔 ，室溫（25～28℃）孵育20分鍾 。

8. 洗板5次 ，且最後一次置厚吸水紙上拍幹 。

9. 加入顯色劑TMB100ul/孔 ，避光室溫（25～28℃）孵育20分鍾 。

10. 加入中止液50ul/孔,混勻後即刻測量OD450值 。

結果判斷:

1.複孔的值在20%的差異範圍內結果才有效 ，複孔的值平均後可作為測量值 。

2.每個標準品或標本的OD值應減去本底校正孔的OD值 。

3.手工繪製標準曲線 。以標準品濃度作橫坐標 ，OD值作縱坐標 ，以平滑線連接各標準品的坐標點 。通過標本的OD值可在標準曲線上查出其濃度 。

4.若標本OD值高於標準曲線上限 ，應適當稀釋後重測 ，計算濃度時應乘以稀釋倍數 。

典型數值和參考曲線

人高敏CRP參考標準曲線

注意 ：本圖僅供參考 ，應以同次試驗標準品所繪標準曲線計算標本含量 。

靈敏度 ，特異性和重複性:

1.靈敏度 ：多次重複結果表明 ，最小檢出量為18.4pg/ml 。

2. 重複性 ：板內 ，板間變異係數均<10%.

參考文獻:

1. Johnson HL et al; Applications of acute phase reactants in infectious diseases J.Microbiol. Immunol. Infect. 1999, 32: 73

2. Helgeson N et al; C - Reactive Protein : Laboratory Medicine, Vol. 2 (Race G. J., Ed.),Harper & Row, Hagerstown, chapter 29 (1973).

3. Gewurz H et al; C-Reactive Protein and the Acute Phase Response. Adv in Int Med, 1982,27: 345

4. Frank, R. and R. Hargreaves (2003) Nat. Rev. Drug Disc. 2:566.