人血管生成素定量分析酶聯免疫檢測試劑盒

本試劑盒僅供科研使用 。用於體外定量檢測人血清 、血漿或細胞培養上清液中的血管生成素濃度 。使用前請仔細閱讀說明書並檢查試劑組

分是否完整 。如有產品包裝破損或質量投拆 ，請在收到貨一個月之內聯係尊龍凱時 。

人血管生成素簡介 ：

人血管生成素是一種非糖基化的多肽 ，有123個氨基酸殘基組成 ，分子量為14 kDa ，含有三個鏈內二硫鍵 ，屬於核糖核酸酶家族 。

血管生成素一般由血管內皮細胞 、平滑肌細胞 、成纖維細胞 、結腸柱狀上皮細胞 、淋巴細胞 、腺癌幹細胞以及腫瘤細胞係等細胞產生 。血管生成素通常以分泌蛋白形式進入血液中 ，其含量高達60-120 ng / mL 。

血管生成素作為核糖核酸酶與其它的核糖核酸酶家族成員一樣 ，具有細胞毒性 ，其機理主要是抑製細胞中蛋白質的合成從而對細胞具有毒性 。血管生成素也可以通過磷脂酶的活化 ，刺激毛細血管和臍靜脈內皮細胞生成甘油二酯以及前列腺素的分泌 。

檢測原理:

本試劑盒采用雙抗體夾心ELISA法檢測樣本中血管生成素的濃度 。血管生成素捕獲抗體已預包被於酶標板上 ，當加入標本或參考品時 ，其中的血管生成素會與捕獲抗體結合 ，其它遊離的成分通過洗滌的過程被除去 。當加入生物素化的抗人血管生成素抗體後 ，抗人血管生成素抗體與血管生成素接合 ，形成夾心的免疫複合物 ，其它遊離的成分通過洗滌的過程被除去 。隨後加入辣根過氧化物酶標記的親合素 。生物素與親合素特異性結合 ，親合素連接的酶就會與夾心的免疫複合物連接起來 ；其它遊離的成分通過洗滌的過程被除去 。最後加入顯色劑 ，若樣本中存在血管生成素將會形成免疫複合物 ，辣根過氧化物酶會催化無色的顯色劑氧化成藍色物質 ，在加入終止液後呈黃色 。通過酶標儀檢測 ，讀其450nm處的OD值 ，血管生成素濃度與OD₄₅₀值之間呈正比 ，通過參考品繪製標準曲線 ，對照未知樣本中OD值 ，即可算出標本中血管生成素濃度 。

人血管生成素定量分析酶聯免疫檢測試劑盒組成:

標本收集:

1.標本的收集請按下列流程進行操作 ；

A.細胞上清標本離心去除懸浮物後即可 ；

B.血清標本應是自然凝固後 ，取上清 ，避免在冰箱中凝固血液 ；

C.血漿標本 ，推薦用EDTA的方法收集 ；

D.若待測樣本不能及時檢測 ，標本收集後請分裝 ，凍存於－20℃ ，避免反複凍融 。

2.血清標本不應添加任何防腐劑或抗凝劑 ；

3.標本應清澈透明 ，檢測前樣本中如有懸浮物應通過離心去除

4.請勿使用溶血 ，高血脂或汙染的標本檢測 ，否則結果將不準確 。

注意事項:

1.試劑盒請保存在2～8℃ 。

2.濃縮洗滌液因在低溫下可能有結晶 ，請水浴加熱使結晶完全溶解後再配製工作液 。

3.標準品複溶加樣後 ，剩餘部份請丟棄 。

4.底物請勿接觸氧化劑和金屬 。

5.加樣時 ，請及時更換槍頭 ，避免交叉汙染 。

6.嚴禁混用不同批號的試劑盒組份 。

7.充分混勻對保證反應結果的準性很重要 ，在加液後請輕輕叩擊邊緣以保證混勻。

8.室溫反應 ，請嚴格控製在25-28℃ 。

9.洗滌過程是至關重要的 ，洗滌不充分會使精確度下降並導致結果誤差較大 。

10.試驗中標準品和樣本檢測時建議作雙複孔 。

11.加樣過程中避免氣泡的產生 。

12.血清和血漿標本的檢測時 ，檢測抗體的孵育時間應適當延長

檢測前準備工作:

1.試劑盒自冰箱中取出後應置室溫（25-28℃）平衡20分鍾 ；每次檢測後剩餘試劑請及時於2～8℃保存 。

2.將濃縮洗滌液用雙蒸水或去離子水稀釋(1份加19份水) 。

3. 將5×標準品稀釋液用雙蒸水或去離子水稀釋(1份加4份水) 。

4.標準品: 按標簽複溶體積加入1X標準品稀釋液複溶使血管生成素終濃度達到500pg/ml ，室溫反應 ，請嚴格控製在25～28℃ ，靜置10~15分鍾後輕輕混懸（建議抽吸幾次）待徹底溶解 ，用標準品稀釋液倍比梯度稀釋後依次加入檢測孔中 。（標準曲線取七個點 ，最高濃度為300 pg/ml,標準品稀釋液直接加入作為0濃度.）

洗滌方法:

自動洗板機或人工洗板 ：每孔洗滌液為300ul ，注入與吸出間隔15-30秒 。洗板5次 。最後一次洗板完成後將板倒扣著在厚吸水紙上用力拍幹 。

實驗過程需自備的材料 ：

1.不同規格的加樣槍及相應的槍頭 ；   

2.酶標儀 ；

3.自動洗板機 ；                     

4.去離子水或雙蒸水 ；

操作步驟:

1.通過計算並確定一次性實驗所需的板條數 ，取出所需板條放置在框架內 ，暫時用不到板條請放回鋁箔袋密封，保存於4℃ 。

2.建議設置本底較正孔 ，即空白孔,設置方法為該孔隻加TMB顯色液和中止液 。每次實驗均需做標準品對照並畫出標準曲線 。

3.分別將標本或不同濃度標準品(100ul/孔)加入相應孔中 ，用封板膠紙封住反應孔 ，室溫（25-28℃）孵育120分鍾 。對於血清或血漿標本 ，請用1×標準品稀釋液稀釋至合適濃度檢測 ，建議稀釋100~8000倍。         

4.洗板5次 ，且最後一次置厚吸水紙上拍幹 。

5.加入生物素化抗體工作液(100ul/孔) 。用封板膠紙封住反應孔 ，室溫（25-28℃）孵育60分鍾 。   

6.洗板5次 ，且最後一次置厚吸水紙上拍幹 。

7.加入親和素連接的酶工作液(100ul/孔) 。用封板膠紙封住反應孔 ，避光室溫（25-28℃）孵育20分鍾 。   

8.洗板5次 ，且最後一次置厚吸水紙上拍幹 。

9.加入顯色劑TMB100ul/孔 ，避光室溫（25-28℃）孵育20分鍾 。

10.加入中止液50ul/孔,混勻後即刻測量OD450值 。

結果判斷:

1.複孔的值在20%的差異範圍內結果才有效 ，複孔的值平均後可作為測量值 。

2.每個標準品或標本的OD值應減去本底校正孔的OD值 。

3.手工繪製標準曲線 。以標準品濃度作橫坐標 ，OD值作縱坐標 ，以平滑線連接各標準品的坐標點 。通過標本的OD值可在標準曲線上查出其濃度 。

4.若標本OD值高於標準曲線上限 ，應適當稀釋後重測 ，計算濃度時應乘以稀釋倍數 。

典型數值和參考曲線

人Angiogenin參考標準曲線

注意 ：本圖僅供參考，應以同次試驗標準品所繪標準曲線計算標本含量 。

靈敏度 ，特異性和重複性:

1.靈敏度 ：多次重複結果表明 ，最小檢出量為4.75pg/ml 。

2.特異性 ：與EGF ，GM-CSF ，MIP-1α ，MIP-1β ，TGF-α ，TGF-β1,小鼠 EGF ，GM-CSF ，MIP-1α等沒有交叉反應 。

3.重複性 ：板內 ，板間變異係數均<10%.

參考文獻:

1. Moroianu, J. and J.F. Riordan (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:1677.

2. Moenner, M. et al. (1994) Eur. J. Biochem. 226:483.

3. Bond, M.D. et al. (1993) Biochem. Biophys. Acta 1162:177.

4. Beintema, J.J. (1989) FEBS Lett. 254:1.

5. Hu, G-F. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2227.

6. Russo, N. et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:2920.