人淋巴毒素α（TNF-β）定量分析酶聯免疫檢測試劑盒

本試劑盒僅供科研使用 。用於體外定量檢測人血清 、血漿或細胞培養上清液中的TNF-β濃度 。使用前請仔細閱讀說明書並檢查試劑組分是否完整, 如有疑問請與安徽巧伊生物科技有限公司聯係 ，尊龍凱時將提供力所能及的幫助 。 

TNF-β簡介 ：

淋巴毒素α ，也叫TNF-β ，是一個屬於腫瘤壞死家族的分泌蛋白 。人的TNF-β是一個22 kDa的蛋白 。分泌型的TNF-β是三倍體 。當然 ，TNF-β也能與淋巴毒素β形成三倍體 ，從而將TNF-β錨定在細胞表麵 。TNF-β由活化的B淋巴細胞分泌 ，對自身免疫病的發生起重要作用 。

TNF-β介導不同類型的炎症反應 ，免疫刺激以及抗病毒等過程 。TNF-β除了對腫瘤細胞的細胞毒性外 ，TNF-β能刺激淋巴腺及淋巴結等淋巴器官的發育 ，參與淋巴器官的炎症及免疫功能 。TNF-β也參與次級淋巴器官的形成和生長 ，同時TNF-β也參與細胞調亡 。TNF-β的基因多態性也會誘導牛皮癬伴隨著血清陰性的關節炎 ，即牛皮癬性關節炎 。

檢測原理:

本試劑盒采用雙抗體夾心ELISA法檢測樣本中TNF-β 的濃度 。TNF-β捕獲抗體已預包被於酶標板上 ，當加入標本或參考品時 ，其中的TNF-β會與捕獲抗體結合 ，其它遊離的成分通過洗滌的過程被除去 。當加入生物素化的抗人TNF-β抗體後 ，抗人TNF-β抗體與TNF-β接合 ，形成夾心的免疫複合物 ，其它遊離的成分通過洗滌的過程被除去 。隨後加入辣根過氧化物酶標記的親合素 。生物素與親合素特異性結合 ，親合素連接的酶就會與夾心的免疫複合物連接起來 ；其它遊離的成分通過洗滌的過程被除去 。最後加入顯色劑 ，若樣本中存在TNF-β將會形成免疫複合物 ，辣根過氧化物酶會催化無色的顯色劑氧化成藍色物質，在加入終止液後呈黃色 。通過酶標儀檢測 ，讀其450nm處的OD值 ，TNF-β濃度與OD₄₅₀值之間呈正比 ，通過參考品繪製標準曲線 ，對照未知樣本中OD值 ，即可算出標本中TNF-β 濃度 。

人TNF-β定量分析酶聯免疫檢測試劑盒組成:

標本收集:

1.標本的收集請按下列流程進行操作 ；

A.細胞上清標本離心去除懸浮物後即可 ；

B.血清標本應是自然凝固後 ，取上清 ，避免在冰箱中凝固血液 ；

C.血漿標本 ，推薦用EDTA的方法收集 ；

D.若待測樣本不能及時檢測 ，標本收集後請分裝 ，凍存於－20℃ ，避免反複凍融 。

2.血清標本不應添加任何防腐劑或抗凝劑 ；

3.標本應清澈透明 ，檢測前樣本中如有懸浮物應通過離心去除 。

4.請勿使用溶血 ，高血脂或汙染的標本檢測 ，否則結果將不準確 。

注意事項:

1.試劑盒請保存在2～8℃ 。

2.濃縮洗滌液因在低溫下可能有結晶 ，請水浴加熱使結晶完全溶解後再配製工作液 。

3.標準品複溶加樣後，剩餘部份請丟棄 。

4.底物請勿接觸氧化劑和金屬 。

5.加樣時 ，請及時更換槍頭 ，避免交叉汙染 。

6.嚴禁混用不同批號的試劑盒組份 。

7.充分混勻對保證反應結果的準性很重要 ，在加液後請輕輕叩擊邊緣以保證混勻 。

8.室溫反應 ，請嚴格控製在25-28℃ 。

9.洗滌過程是至關重要的 ，洗滌不充分會使精確度下降並導致結果誤差較大。

10.試驗中標準品和樣本檢測時建議作雙複孔 。

11.加樣過程中避免氣泡的產生 。

12.血清和血漿標本的檢測時 ，檢測抗體的孵育時間應適當延長

檢測前準備工作:

1.試劑盒自冰箱中取出後應置室溫（25-28℃）平衡20分鍾 ；每次檢測後剩餘試劑請及時於2～8℃保存 。

2.將濃縮洗滌液用雙蒸水或去離子水稀釋(1份加19份水) 。

3.如有5x標準品稀釋液 ，請按所需量用雙蒸水或去離子水稀釋(1份加4水) 。

4 標準品: 根據標簽複溶體積加入標準品稀釋液使TNF-β終濃度達到2000pg/ml ，室溫反應 ，請嚴格控製在25～28℃ ，靜置15~20分鍾後輕輕混懸（建議抽吸幾次）待徹底溶解 ，用標準品稀釋液倍比梯度稀釋後依次加入檢測孔中 。（標準曲線取七個點 ，最高濃度為2000 pg/ml,標準品稀釋液直接加入作為0濃度.）

洗滌方法:

自動洗板機或人工洗板 ：每孔洗滌液為300ul ，注入與吸出間隔15-30秒 。最後一次洗板完成後將板倒扣著在厚吸水紙上用力拍幹 。

實驗過程需自備的材料 ：

1.不同規格的加樣槍及相應的槍頭 ；   

2.酶標儀 ；

3.自動洗板機 ；                    

4.去離子水或雙蒸水 ；

操作步驟:

1.通過計算並確定一次性實驗所需的板條數 ，取出所需板條放置在框架內 ，暫時用不到板條請放回鋁箔袋密封 ，保存於4℃ 。

2.建議設置本底較正孔 ，即空白孔,設置方法為該孔隻加TMB顯色液和中止液 。每次實驗均需做標準品對照並畫出標準曲線 。

3.分別將標本或不同濃度標準品(100ul/孔)加入相應孔中 ，用封板膠紙封住反應孔 ，室溫（25-28℃）孵育120分鍾 。4.洗板5次 ，且最後一次置厚吸水紙上拍幹 。

5.加入生物素化抗體工作液(100ul/孔) 。用封板膠紙封住反應孔 ，室溫（25-28℃）孵育60分鍾。    

6.洗板5次 ，且最後一次置厚吸水紙上拍幹 。

7.加入HRP酶結合物工作液(100ul/孔) 。用封板膠紙封住反應孔 ，避光室溫（25-28℃）孵育20分鍾 。

8.洗板5次 ，且最後一次置厚吸水紙上拍幹 。

9.加入顯色劑TMB100ul/孔 ，避光室溫（25-28℃）孵育20分鍾 。

10.加入中止液50ul/孔,混勻後即刻測量OD450值 。

結果判斷:

1.複孔的值在20%的差異範圍內結果才有效 ，複孔的值平均後可作為測量值 。

2.每個標準品或標本的OD值應減去本底校正孔的OD值 。

3.手工繪製標準曲線 。以標準品濃度作橫坐標 ，OD值作縱坐標 ，以平滑線連接各標準品的坐標點 。通過標本的OD值可在標準曲線上查出其濃度 。

4.若標本OD值高於標準曲線上限 ，應適當稀釋後重測 ，計算濃度時應乘以稀釋倍數 。

典型數值和參考曲線

人TNF-β參考標準曲線

注意 ：本圖僅供參考 ，應以同次試驗標準品所繪標準曲線計算標本含量 。

靈敏度 ，特異性和重複性:

1.靈敏度 ：多次重複結果表明 ，最小檢出量為15.4pg/ml 。

2.特異性 ：與人的GM-CSF ，IL-8 ，IL-1β ， TNF-α及小鼠的TNF-α等沒有交叉反應 。

3.重複性 ：板內 ，板間變異係數均<10%.

參考文獻 ：

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5. Mapara, M.Y. et al. (1994) Int. J. Cancer 58:248.

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