種屬

人

細胞來源

上海市東方醫院

生長特性

貼壁 球形克隆

培養條件

培養基 ：STEMCELL的mTSR1 ，人胚胎幹細胞無飼養層培養基

溫度 ：37℃     氣相：95%空氣,5% CO2

傳代

1.用75%酒精噴灑整個培養瓶消毒 ，將其平躺置於培養箱中進行1-3小時的緩衝 ，.然後置於無菌操作台 ，打開瓶口 ，將其中的培養液去掉 ，再往其中加入5-6mL新鮮培養基(以T25培養瓶為例)並置於細胞培養箱中培養 ，根據細胞生長狀況及培養基顏色變化對其進行換液以及傳代 ，每次傳代48h後一天換一次 ；

2.待細胞克隆還沒開始融合時 ，需要對其進行傳代 ，傳代比例為1:4 ；

3傳代步驟 ：將1 mg/mL膠原酶IV消化液置於37°預熱 ，倒掉培養瓶中的培養基 ，往培養瓶中加入3-5 ml PBS ，輕晃洗滌後棄去 。往瓶中加2 ml預熱好的膠原酶 ，置於37°孵育消化（第一次消化需時常取出置於顯微鏡下觀察 ，以顯微鏡下細胞觸角回收變圓 、輕拍瓶壁見細胞脫落為最佳消化時間 ，記錄最佳消化時間 ，以便於下次消化 ，前30min觀察一次 ，之後每15min觀察一次）一般孵育30-60min左右 ，消化好後加入5ml完全培養基 。用移液槍輕輕吹打瓶壁上的細胞 ，使之完全脫落 ，然後收集細胞懸液 ，置於15ml離心管中 ，待細胞自然沉降後將上層Collagenase-type IV吸除 ，加入hES完全培養液5 ml ，吹打2-3次 ，待細胞自然沉降後將上層培養液吸除 。再加入培養液重懸細胞傳代 。每次傳代後48h內不要移動 。

保存

凍存條件 ：60%完全培養基+30%FBS（ES級）+10%DMSO

(備注 ：建議使用本公司的冷凍液（H-W-100） ，用4度保存的冷凍液直接重懸細胞 ，不能預熱後使用 。)

保存條件 ：液氮存儲

供應限製

僅供研究之用

常見問題及解決方案

1.培養瓶有破裂 ，培養液有漏液 ：細胞極大可能會汙染 ，所以尊龍凱時會及時安排幫老師解決 。

2.細胞漂浮 ：培養瓶不開封 ，瓶口酒精擦拭後平躺放置在培養箱 。1-2小時後觀察 ，如細胞大部分又貼回瓶底 ，表明細胞活力正常，剩餘漂浮的細胞可以去掉 ，留8-10ml培養液培養觀察 ，細胞生長至匯合度80% ，進行消化傳代 ；如細胞還是不貼壁 ，將細胞離心收集轉到新培養瓶 ，原培養瓶加部分培養液繼續培養 ，中間注意觀察 ，尊龍凱時的技術人員會一直跟蹤指導 ，直到問題解決 。