幹細胞凍存是幹細胞擴增傳代過程中重要的一環 ，但是幹細胞不同於普通細胞係 ，其增殖擴增過程中需要聚團生長 ，為保持其細胞活性 ，不建議單細胞傳代 。而且使用血清+DMSO凍存方法 ，不能很好的保持細胞活性 ，且複蘇細胞成活率較低 。這次就重點介紹幹細胞進行凍存以及解凍的標準化步驟 。

　　本方法適用於HAKATA™ 人間充質幹細胞無血清培養基以及HAKATA™ 無血清細胞凍存液培養的細胞（同樣適用於mTesR以及E8係統培養的細胞） ，凍存以及複蘇前後 ，應當使用同一種培養基 ，複蘇傳代後可以更換其他培養體係 。

HAKATA™ 無血清細胞凍存液是尊龍凱時生物獨家研製的的一款化學成分確定 ，無血清 ，無動物源成分 ，且無需程序降溫的高效凍存液 。具體凍存及複蘇操作方法如下 ：

1 、凍存 ：以下操作方法以6孔板為例 ：

　　注意 ：如果使用mFreSR™ ，請將所需量的mFreSR™融化並置於冰上 。

　　（1） HAKATA™ 無血清細胞凍存液為即拿即用，且4℃保存 ，凍存液拿出後應快速放回4℃ ；

　　（2）使用幹細胞消化液消化細胞 ；

（3）收集細胞 ，室溫300×g離心5分鍾 ；

　　（3）小心吸掉上清液 ，不要幹擾細胞團 ；

　　（4）用1ml凍存液重懸細胞，並均勻分裝到凍存管中

　　采用非程序降溫法 ，將凍存管直接放入-80℃冰箱中 ，凍存24h後轉移至液氮中長期保存 。　　

　　2 、解凍

　　預先包被細胞培養板 ，人ES和iPS細胞解凍後應立即接種到培養板中 。

　　（1）幹細胞培養基室溫平衡15-30min,不能37℃加熱; 　　

（2）在水浴鍋中持續晃動凍存管 ，37℃水浴鍋中快速解凍細胞 ，直至細胞完全融化 ；　

（3）取出凍存管 ，用70％乙醇擦拭凍存管表麵 ；

　　（4）準備15ml離心管 ，預先加入5mL幹細胞培養基 ，將細胞懸浮液緩慢逐滴至15mL離心管中 ，盡量保持細胞聚團狀態 。

　　（5）在室溫300×g離心5分鍾 。

　　（6）吸掉上清 ，注意不要幹擾細胞沉澱 。使用1mL多能幹細胞培養基輕輕地重懸細胞3-5次 ，不要破壞細胞聚團狀態 。

　　（7）分別取0.5mL細胞懸液 ，均勻接種到包被好的6孔板的2個孔中 ，並分別補充多能幹細胞培養基至2m 。

　　（8）置於37°C細胞培養箱中 。在前後左右呈十字形搖動培養板板5次 ，以均勻分散細胞。

　　（9）每天更換培養基 ，並顯微鏡下觀察細胞狀 。