細胞傳代培養是細胞培養常規保種方法之一 ，也是幾乎所有細胞生物學實驗的基礎 。當細胞隨著培養時間的延長和細胞不斷分裂 ，細胞之間相互接觸而發生接觸性抑製 ，生長速度減慢甚至停止 ，且也會因營養物不足和代謝物積累而不利於細胞生長或發生中毒 。因此 ，細胞在培養瓶中長滿後就需要將其稀釋 ，分種成多瓶 ，細胞才能繼續生長 。這一過程就叫傳代 。

細胞傳代作為一種常規的實驗操作 ，不但可以擴大細胞培養的數量 ，同時也可以避免細胞因進入平台期乃至衰亡期而大量死亡的窘境 。所以為了讓細胞保持在對數生長期 ，維持細胞旺盛的分裂能力 ，這時候就需要進行細胞傳代 。

細胞傳代要在嚴格的無菌條件下進行 ，並且根據不同細胞采取不同的方法 ：

☑ 貼壁生長的細胞用消化法傳代 ；

☑ 部分貼壁生長但貼壁不牢固的細胞可以采用直接吹打傳代 ；

☑ 懸浮生長的細胞可以采用直接吹打或離心沉澱後再分離傳代 ，或直接用自然沉澱法吸除上清後 ，再吹打傳代 。

上次講了細胞複蘇操作 ，今天來講講細胞傳代的操作（適用於貼壁細胞的傳代培養） ！

細胞複蘇流程圖

細胞傳代流程圖

01

細胞傳代前準備

➡ 實驗開始前 ，將15mL離心管 、移液管 、槍頭等實驗需要用到的耗材放入無菌超淨工作台 ，紫外線照射30min 。

➡ 將完全培養基 、PBS 、胰酶預熱至37℃ 。

➡ 倒置顯微鏡下觀察細胞形態和生長密度 ，當細胞生長密度達到80%~90%匯合度即可進行傳代 。

02

胰蛋白酶/EDTA消化

➡ 棄去舊培養基 ，PBS洗去殘留的舊培養基 ，重複洗兩次 。

注意 ：

貼壁加入到培養皿的邊緣 ，不能直接對著細胞加入PBS ，容易把細胞都吹起來 。這一步的目的是為了去掉殘餘的培養基 ，殘餘的培養基會含有血清和一些離子等 ，不利於接下來的消化 。

➡ 棄去PBS ，加入0.25%Trypsin-0.04%EDTA（T25培養瓶加入約1.5mL ，T75培養瓶加入約3mL） ，迅速鋪勻 ，保證充分接觸細胞表麵（消化時間視具體細胞而定） 。

➡ 顯微鏡下觀察消化情況 ，約70%~80%細胞收縮變圓後 ，輕拍培養容器外壁 ，使細胞脫離培養表麵 。立即加入2倍胰酶量的完全培養基輕搖培養容器 ，使培養基和胰酶迅速混勻 ，終止消化 。

➡ 使用吸管或移液管輕輕吹打細胞表麵 ，吹打培養容器底麵數次 ，盡可能將細胞都吹打下來 。

注意 ：

吹打動作不可劇烈 ，避免產生大量氣泡 ，否則可能損傷和損失細胞 。

➡ 取所有細胞懸液放入無菌15mL離心管內 ，250×g ，室溫離心4min 。

03

細胞培養

➡ 離心後去除上清 。加入適量完全培養基 ，輕柔吹打細胞沉澱 ，充分吹散 、混勻 ，計數 。將細胞按(2.5~4)×104個活細胞/cm2接種至適宜的培養容器內 。

➡ 搖勻細胞 ，放入37℃ 、5%CO2 、飽和濕度的CO2培養箱中 。

➡ 傳代次日 ，觀察細胞狀態 。若發現較多漂浮細胞 ，應予以換液 。

➡ 待細胞生長至80%~90%匯合度 ，即需傳代或凍存。

注意事項

胰酶濃度

推薦胰酶使用濃度為0.25%-0.04%EDTA ，使用之前需預熱至37℃且pH值應維持在7.2左右 。切忌消化過度（包括胰酶濃度過高 、消化時間過長等） ，否則會導致細胞死亡 、分化 、狀態變差 ，分化能力丟失等現象 。細胞消化過程中需要在顯微鏡下觀察細胞的消化程度 ，當看到大部分細胞變圓不貼壁 ，拍打培養瓶兩側會有大量細胞脫落 ，此時應立即終止消化 ；若細胞仍有大部分貼壁 ，可適當延長消化時間以避免消化不徹底的情況出現 。

細胞的差異

不同種類的幹細胞差異很大 ，特別是與腫瘤細胞株的差異更大 ，很多經驗不可以直接使用 ，消化時需要仔細摸索最佳的時間 。

接種密度

幹細胞傳代過程中接種密度至關重要 ，如果太低會導致細胞增殖緩慢 ，甚至導致細胞老化 ，而細胞的老化是不可逆轉的 。一般細胞接種密度為20000個活細胞/cm2即5×105個活細胞/T25 ，不同的幹細胞接種密度會稍有差異 ，比如hMSC ，尊龍凱時推薦的傳代接種比例為1:2 。

吹打細胞動作要輕柔

吹打動作不可劇烈 ，避免產生大量氣泡 ，否則可能損傷和損失細胞 。