1.如何選擇培養基 ？

培養某一類型細胞沒有固定的培養條件 。在 MEM 中培養的細胞 ，很可能在 DMEM 或 M199 中同樣很容易生長 。總之 ，首選 MEM 做粘附細胞培養、RPMI-1640 做懸浮細胞培養 ，各種目的無血清培養的首選是 AIM V 培養基（SFM） 。

2.為什麽要熱滅活血清 ？

加熱可以滅活補體係統 。激活的補體參與溶解細胞事件，刺激平滑肌收縮 ，細胞和血小板釋放組胺 ，激活淋巴細胞和巨噬細胞 。在進行免疫學研究 、培養 ES 細胞 、昆蟲細胞和平滑肌細胞時 ，推薦使用熱滅活血清 。

3.L-穀氨酰胺在細胞培養中重要嗎 ？它在溶液中不穩定嗎 ？

L-穀氨酰胺在細胞培養時是重要的 。脫掉氨基後 ，L-穀氨酰胺可作為培養細胞的能量來源 、參與蛋白質的合成和核酸代謝 。L-穀氨酰胺在溶液中經過一段時間後會降解 ，但是確切的降解率一直沒有最終確定 。L-穀氨酰胺的降解導致氨的形成 ，而氨對於一些細胞具有毒性 。

4.GlutaMAX-I 是什麽 ？培養細胞如何利用 GlutaMAX-I ？這個二肽有多穩定 ？

GlutaMAX-I 二肽是 L-穀氨酰胺的衍生物 ，將其不穩定的 α-氨基用 L-丙氨酸來保護 。一種肽酶逐漸裂解二肽 ，釋放 L-穀氨酰胺供利用 。GlutaMAX-I 二肽非常穩定 ，即使在 121 磅滅菌 20 分鍾 ，GlutaMAX-I 二肽溶液有最小的降解 ，如果在相同條件下 ，L-穀氨酰胺幾乎完全降解 。

5.為什麽培養基中可以省去加酚紅 ？

酚紅在培養基中被用來作為 PH 值的指示劑 ：中性時為紅色 ，酸性時為黃色 ，堿性時為紫色 。研究表明 ，酚紅可以模擬固醇類激素的作用（特別是雌激素） 。為避免固醇類反應 ，培養細胞 ，尤其是哺乳類細胞時 ，用不加酚紅的培養基 。由於酚紅幹擾檢測 ，一些研究人員在做流式細胞檢測時 ，不使用加有酚紅的培養基 。

6.如何用台盼蘭計數活細胞 ？

用無血清培養基把細胞懸液稀釋到 200-2000 個/毫升 ，在 0.1 毫升的細胞中加入 0.1 毫升的 0.4％的台盼蘭溶液 。輕輕混勻 ，數分鍾後 ，用血球計數板計數細胞 。活細胞排斥台盼蘭 ，因而染成藍色的細胞是死細胞 。

7.如何消除組織培養的汙染 ？

當重要的培養汙染時 ，研究者可能試圖消除或控製汙染 。首先 ，確定汙染物是細菌 、真菌 、支原體或酵母 ，把汙染細胞與其它細胞係隔離開 ，用實驗室消毒劑消毒培養器皿和超淨台 ，檢查 HEPA 過濾器 。高濃度的抗生素和抗黴菌素可能對一些細胞係有毒性 ，因而 ，做劑量反應實驗確定抗生素和抗黴菌素產生毒性的劑量水平 。這點在使用抗生素如兩性黴素 B 和抗黴菌素如泰樂菌素時尤其重要 。下麵是推薦的確定毒性水平和消除培養汙染的實驗步驟 。

1)在無抗生素的培養基中消化 、計數和稀釋細胞 ，稀釋到常規細胞傳代的濃度 。

2)分散細胞懸液到多孔培養板中 ，或幾個小培養瓶中 。在一個濃度梯度範圍內 ，把選擇抗生素加入到每一個孔中 。例如 ，兩性黴素 B 推薦下列濃度 ，0.25 ，0.50 ，1.0 ，2.0 ，4.0,8.0 mg/ml 。

3)每天觀測細胞毒性指標 ，如脫落 ，出現空泡 ，匯合度下降和變圓 。

4)確定抗生素毒性水平後 ，使用低於毒性濃度 2-3 倍濃度的抗生素的培養液培養細胞 2-3 代 。

5)在無抗生素的培養基中培養細胞一代 。

6)重複步驟 4 。

7)在無抗生素的培養基中培養 4-6 代 ，確定汙染是否以已被消除 。

8.培養基中丙酮酸鈉的作用是什麽 ？

丙酮酸鈉可以作為細胞培養中的替代碳源 。盡管細胞更傾向於以葡萄糖作為碳源 ，但是 ，如果沒有葡萄糖的話 ，細胞也可以代謝丙酮酸鈉 。

9.Hank’s 平衡鹽溶液（HBS）要在空氣中使用 ，不需要 CO2 培養箱 。原因是什麽 ？

Hank’s 平衡鹽溶液（HBS）和 Earle’s 平衡鹽溶液（EBS）有什麽本質的功能差別？HBS 和 EBS 的主要差別在於碳酸氫鈉的水平 ，碳酸氫鈉的含量在 Eagles (2.2g/L)中比在 Hanks (0.35g/L) 中高 。碳酸氫鈉需用高水平的 CO2 平衡 ，以維持溶液的PH 值 。Eagles 液在空氣水平的 CO2 中 ，溶液會變堿 ，Hanks 液在 CO2 培養箱中會變酸 。如果希望在 CO2 培養箱中保存組織 ，需要用 Eagles 液 。如果僅僅是清洗將要在細胞培養基中儲存的組織 ，用 Hanks 液就可以了 。

10.Qualified 和 Certified 胎牛血清有什麽差別?

Certified 胎牛血清包括了 Qualified 胎牛血清執行的所有的標準檢驗程序 ，而且除了這些標準檢測 ，Certified 胎牛血清還有如下一些附加的檢測 ：

End-Point Determination of Endotoxin Content

噬菌體檢驗

生物化學檢測

激素的檢測

血紅蛋白檢測

Sf9 細胞生長促進及方法學檢測

11.二價離子抑製胰蛋白酶活性嗎 ？使用胰蛋白酶時加入 EDTA 的目的是什麽 ？

二價離子的確抑製胰蛋白酶活性 。EDTA 用來螯合遊離的鎂離子和鈣離子 ，以便保持抑製胰蛋白酶的活性 。建議胰蛋白酶處理細胞前 ，用 EDTA 清洗細胞 ，以消除來自培養基中所有的二價離子 。

12.製備 lipid-DNA 的方法會影響轉染效率嗎？

是的 。對於 LIPOFECTAMlNE Reagent ，稀釋試劑在 100µl OPTI-MEM 中 ，稀釋 DNA 在 100µl OPTI-MEM 中 。混合兩種溶液在室溫下孵育 15 分鍾 。對於 LIPOFECTIN Reagent，在加入 DNA 溶液前允許稀釋的試劑和培養基孵育至少 30 分鍾可以增加 3 倍的效率 。確保複合物在沒有血清的情況下形成 。孵育 15 分鍾後 ，在複合物中加入含有血清的培養基（800µl） 。（注意以上是 35mm 培養皿使用體積） 。對於 LIPOFECTAMlNE Plus Reagent DNA 應該在與脂質體混合之前首先與 Plus Reagent混合 。LIPOFECTAMlNE 2000 的操作步驟允許在一個很小的體積下混合 DNA 和脂質體 ，接下來可以不需要換培養基的情況下直接加入 。

13.我使用 SF900 Ⅱ時 ，細胞生長良好 ，但是為什麽我的蛋白產物不如使用 Graces 液和 10%胎牛血清時效果好 ？

如果目的蛋白是一個後期蛋白 ，它將與蛋白酶一起表達 ，這些蛋白酶將會作用於目的蛋白 。在加有血清的培養基中 ，這些蛋白酶將作用到血清中的蛋白 ，從而使目的蛋白產品保持完好 。在無血清配方中 ，蛋白酶作用的唯一底物是你的目的蛋白 。為了避免這一問題 ，加入一些蛋白酶抑製劑或加入少量的血清（少於 1％） ，讓血清給蛋白酶提供作用底物 。

14.如何檢測內毒素(熱源)水平 ？

LAL（Limulus Amebocyte Lysate）試驗是可用的最敏感和特異的檢測細菌內毒素的方法 。Levin 和 Bang 發現細菌可引起鱟（Limulus polyphemus）血管內的凝集作用 。內毒素啟動一個細胞內酶原係統（絲氨酸蛋白酶級聯反應係統） ，通過修飾凝集素 ，產生一種透明的膠 ，LAL 中的凝固蛋白 ，從而 ，形成不可溶的基質 。LAL試劑緩衝的鱟（血細胞）裂解物 。

胎牛血清的內毒素檢測是在 Grand Island ，按照手冊上 Gel-clot 方法進行的 。在對血清產品進行內毒素檢測前 ，用無熱源的水 1 ：10 稀釋樣品 。稀釋樣品沸水育 5分鍾 ，以消除抑製劑 。（通常 ，血液中的內毒素結合成份的出現會抑製凝膠過程 ，使內毒素不能與 LAL 反應。樣品預先熱處理可以消除這種抑製作用 。）

15.我可以使用固體形式的 Murashige Skog 培養基嗎 ？

如果使用固體形式的培養基 ，需要加入瓊脂 。瓊脂加入前要先滅菌 。應該避免 MS 培養基的直接滅菌 ，應該高壓滅菌瓊脂溶液 ，然後把融化的瓊脂溶液加入到 MS 培養基中。

16. 20℃下配製的緩衝液 ，在較高或較低的溫度下 PH 值會改變嗎 ？

對於普通使用的緩衝液 ，PH 值隨溫度變化而變化 。下表列出溫度改變 10℃時 ，PH 值的變化情況

例如 20℃下配製 PH7.4 Tris 緩衝液,40℃時 PH 值為 7.4-（2x0.310）＝6.78

17. 室溫下(25℃)配製的 Tris-HCl 溶液 ，在 37℃使用時 PH 值是多少 ？

緩衝液的 PH 值隨溫度變化而變化 。下表列出了 50mM Tris-HC 溶液在 4℃ ，25℃ ，37℃時 ，不同的 PH 值 。

4°C 25°C 37°C

8.1 7.5 7.2

8.2 7.6 7.3

8.3 7.7 7.4

8.4 7.8 7.5

8.5 7.9 7.6

8.6 8.0 7.7

8.7 8.1 7.8

8.8 8.2 7.9

8.9 8.3 8.0

9.0 8.4 8.1

9.1 8.5 8.2

9.2 8.6 8.3

9.3 8.7 8.4

9.4 8.8 8.5

18. 昆蟲細胞培養的最適 PH 值和滲透壓是多少 ？

生長培養基的 PH 值對細胞的增值和病毒或重組蛋白的生產均會產生影響 。對於大部分鱗翅類昆蟲細胞係 ，在 PH 值 6.0-6.4 範圍的大部分應用效果良好 。培養鱗翅類昆蟲細胞係時 ，培養基的最適滲透壓是 345-380mOsm/kg. 。為保證可靠和持久的細胞培養方式 ，減少技術問題 ，保持 PH 值和滲透壓在以上所列的範圍之內 。

19. High Five 細胞有任何其它名稱嗎 ？

High Five 細胞也被稱為 Trichoplasia ni 5B1-4 和 BTI-TN-5B1-4 。

20.在 High Five 無血清培養基中去汙劑的濃度是多少 ？

High Five 無血清培養基中去汙劑的濃度 ：0.025 g/L Tween-80 ，1.0 g/L Pluronic Poly-all 。

21.High Five 細胞用多大的密度凍存 ？

3.0x10E6 cells/ml

22.在我的果蠅培養基中發現形成白色沉澱 ，加熱後溶解 。它是什麽 ？對我的細胞有害嗎 ？

可能是穀氨酰胺沉澱 ，但是更可能是 L-酪氨酸沉澱 。培養基中穀氨酰胺的濃度比典型的 2mM 高 6 倍 。酪氨酸的濃度比在 RPMI 1640 中高 25 倍 ，而且比穀氨酰胺更

加難以溶解 。沉澱也可能是不止一種成分的複合物 。它可能是由於貯存在局部溫度較低的地方引起 。隻要沉澱在培養條件下可以溶解 ，對實驗不會有不利的影響 。

23.如何從 T25 瓶中轉移 sf9 細胞 ？能用胰蛋白酶消化嗎 ？

尊龍凱時強力推薦使用脫落細胞的方法 ，因為這項技術破壞性最小 ，生活力最高 。通過使用巴氏德吸液管 ，讓細胞上培養基流動 。作為一種選擇你也可以輕輕拍打培養瓶 。

隻有在絕對必要的情況下 ，才使用胰酶消化細胞 。

胰酶消化一個 T25 瓶的 sf9 細胞 ：

1)去除培養基 。

2) 用 2ml 1xPBS（足以覆蓋細胞表麵）洗滌細胞 ，去除 PBS.

3) 加入 2ml 1x 胰酶 EDTA（恰好覆蓋細胞表麵） 。

4) 37 ℃孵育 5 到 10 分鍾 。在儀器下檢測看到 5 分鍾後它們正在向上移動 。

5) 向細胞中加入 2ml 細胞培養液 ，移入錐形管 ，用 2ml 培養液洗瓶壁 ，移入同一錐形管中 。（培養基中的 FBS 終止了胰酶的活性 。）

6) 離心（1100rpm）沉澱細胞 。去除培養基 。

7) 用新的培養基重新懸浮細胞 。傳代 。

24.在 Sf9, Sf21, 和 high Five 細胞懸浮培養時 ，肝素的使用量是多少 ？

為了防止懸浮培養細胞聚集的形成 ，使用肝素濃度為 10 單位/毫升細胞懸液 。

25.如何評估 ES 細胞合格的胎牛血清 ？

使用 D3 ES 細胞 。這是一個對於胎牛血清中生長促進 、生長抑製和分化因子非常敏感的細胞係 。相關生長效率分析 ：當 ES 細胞以非常低的密度傳入包含 10％胎牛血清的生長培養基中 ，檢測開始和支持 ES 細胞克隆的能力 。

細胞毒分析 ：

當以非常低的密度傳入包含 30％胎牛血清的生長培養基中 ，檢測 ES 細胞和 feeder 細胞的生長能力 。

相關形態學和分化分析 ：

檢測胎牛血清支持未分化 ES 細胞克隆的能力 。通過堿性磷酸酶活性評估分化程度 。未分化的 ES 細胞小顏色深紅粉紅 ，分化的細胞較大 ，豐滿 ，顏色較淺 。

所有的分析在沒有 ESGRO 的情況下進行的 ，培養基中出現 ESGRO 會掩蓋由胎牛血清所導致的問題 。（ESGRO 或 LIF 經常用來保持 ES 細胞處於未分化狀態 。）

經過培養發現 ，大約 8 批中有 1 批可以用來培養 ES 細胞 。

26.在重新凍存 sf9 細胞前 ，它可以傳多少代？隨著傳代的次數的增加 ，它的感染能力會降低嗎 ？

通常情況當細胞經過 30 次傳代後 ，應該返回凍存 。無論什麽時候記數時 ，都應該檢查細胞活力 。如果超過 95％的細胞保持有活力和在大約 30 小時左右加倍 ，細胞仍然可以使用 。如果活力和加倍時間下降 ，它們的感染力將不在是有效的。