細胞冷凍保存

1.材料:

生長良好之培養細胞 、新鮮培養基 、DMSO (Sigma D-2650) 、無菌塑料冷凍保存管(Nalgene 5000-0020)  、0. 4%

( w/v) trypan blue (G ibcoBRL15250-061) 、血球計數盤與蓋玻片 、等速降溫機(KRY010SeriesII)

2 、冷凍保存方法:

(1)傳統方法:冷存管置於4C10分鍾-->-20C30分鍾-->-80C 16~ 18小時(或隔夜)-->液氮槽vaporphase

長期儲存 。

-20C不可超過1小時 ，以防止胞內冰晶過大 ，造成細胞大量死亡 ，亦可跳過此步驟直接放入-80C冰箱中 ，惟存

活率稍微降低一些 。

(2)程序降溫:利用已設定程序的等速降溫機以-1~-3C/分鍾之速度由室溫降至(-80C以下) -120C ，再放

在液氮槽vaporphase長期儲存。適用於懸浮型細胞與hybridoma之保存 。

(3)HAKATA無血清細胞凍存 ： 加入HAKATA無血清細胞凍存液製成懸液 ，直接凍於-80°C ，可保存≥5年 。

3 、步驟:

(1)冷凍前24-48小時更換半裏或全裏培養基 ，使細胞處於指數生長期 。

(2)配製冷凍保存溶液(使用前配製):另取一離心管 ，加入培養基 、血清 ，逐滴加入二甲基亞礬(DMSO)至20%

濃度 ，即製成雙倍的凍存液 ，置於室溫下待用 。

(3)離心收集培養之細胞 ，用加血清的培養基重懸起細胞 ，取少裏細胞懸浮液(約0.1m1)計數細胞濃度及凍前

存活率 。

(4)取與細胞懸液等裏的凍存液 ，緩慢逐商加入細胞懸液 ，並晃動試管 ，製成細胞凍存懸液( DMSO最後濃度為

5~ 10%) ，使細胞濃度為1~5x 10*cells/ml ，混合均勻 ，分裝於已標示完全之冷凍保存管中 ，1~ 2nl/mal,並取.

少裏細胞懸浮液作汙染檢測 。嚴密封口後 ，注明細胞名稱 、代數 、日期 。然後進行凍存 。

4 、注意事項:

(1)欲冷凍保存之細胞應在生長良好(logphase)且存活率高之狀態 ，約為80~90%致密度 。冷凍前檢則細胞是

否仍保有其特有性質 ，例如hybridoma應在冷凍保存前一至二日測試是否有抗體之產生 。

(2)細胞在液氮中可長期凍存無限時間 ，而不會影響細胞活力;在-70度可保存數月 。

(3)注意冷凍保護劑之品質 。DISO應為試劑級等級 ，無菌且無色以0. 22micron FGLP Telflon過濾或是直

接購買無菌產品 ，如Sigma D-2650) ，以5~ 10mI小體積分裝 ，4C避光保存 ，勿作多次解凍 。Glycerol亦應為試劑

級等級 ，以高壓蒸汽滅菌後避光保存 。在開啟後一年內使用 ，因長期儲存後對細胞會有毒性 。本方法中先製備雙倍凍

存液 ，可避免DMSO直接加入時釋放的熱裏對細胞的損傷 。緩慢逐滴加入細胞懸液是使細胞逐步適應高參 ，可降低細

胞受損 。DMSO可能引起部分白血病細胞株的分化 ，可換用10%甘油凍存 。

(4)冷凍保存Z細胞濃度:

①normal human fibroblast : 1~ 3x 10'ce1ls/ml

②hybridoma: 1~3x 10*cells/m1,細胞濃度不要太高 ，某些hybridoma會因冷凍濃度太高而在解凍24小時後死

去 。

⑤adherent tumor lines:5~ 7x10 ，依細胞種類而異 。Adenocarcinoma解凍後須較高之濃度 ，而HeLa隻需1~

3x 10'cells/ml

⑨other suspensions:5~ 10X 10'cells/ml ，human lymphocyte 須至少5X 10'cells/ml 。

(5)冷凍保護劑濃度為5或10%DMSO, 若是不確定細胞之冷凍條件 ，在做冷凍保存之同時 ，亦應作一個backup

culture,以防止冷凍失敗 。

(6)凍存可用10%~90%的血清 ，一般高濃度血清有助於維護細胞活力 ，此處介紹20%終濃度有利於細胞懸浮而

少沉積(4 度時) ，複蘇存活率在80%~90%以上 ，對原代培養細胞 ，以90%血清凍存更為有效 。