細胞凍存液的配方是什麽
細胞深低溫保存的基本原理是
:在-70℃以下時
,細胞內的酶活性均己停止
,即代謝處於完全停止狀態
,故可以長期保存
。細胞低溫保存的關鍵
,在於通過0~20℃階段的處理過程
。在此溫度範圍內
,水晶呈針狀
,極易招致細胞的嚴重損傷
。 總的原則是緩慢凍存
!
!
!
一 材料
:
生長良好之培養細胞 ,新鮮培養基 , DMSO ,無菌塑料冷凍保存管 ,血球計數盤與蓋玻片 。
二步驟 :
2.1 冷凍前一日前更換半量或全量培養基
,觀察細胞生長情形,最好細胞應該處於對數生長期
。
2.2. 配製冷凍保存溶液(使用前配製)
:將DMSO 加入新鮮培養基中
,最後濃度為5-10%
,混合均勻
,置於室溫下待用
。
2.3. 依細胞傳代培養之操作
,收集培養之細胞與凍存管內
,取少量細胞懸浮液(約0.1 ml) 計數細胞濃度
。
2.4. 先將凍存管放入4℃冰箱 ,約40min 。
2.5 接著置於-20℃冰箱 ,約30-60min 。
2.6. 置於-80超低溫冰箱中放置過夜 。
2.7. 置於液氮罐中長期保存 。
2.8 同時做好凍存記錄 ,在自己的筆記本和凍存記錄本上均要記錄 。
三 注意事項 :
3.1.使用DMSO前 ,不需要進行高壓滅菌 ,它本身就有滅菌的作用 。高壓滅菌反而會破壞它的分子結構 ,以至於降低冷凍保護效果 。
在常溫下 ,DMSO對人體有害 ,故在配製時最好戴上手套操作 。
混合DMSO要快 ,因為DMSO對細胞有毒性 ,混合之後應盡快凍存 ,提醒各位注意的是加入凍存液後一定要混勻 ,防止DMSO沉澱。
凍存液比例培養基7
:血清2
:DMSO1
,也有將血清比例加大的做法
,有的甚至將血清提高到90%
,具體濃度視經驗而定
,但是好多人認為胎牛血清含量越高越好
!
常用的細胞凍存液配方為 :
20%血清(FBS)、10%DMSO 、70%培養基 ;
或90%血清(FBS) 、10%DMSO ,更可防止細胞內冰晶形成 。
3.2.不宜將凍存細胞放置在0℃~-60℃這一溫度範圍內過久 ,低溫損傷主要發生在這一溫度區內,是“危險溫區” 。
可以先在泡沫上打孔 ,把凍存管塞進去 。這樣降溫可以慢一點 ,當然包上棉花也是不錯的主意
3.3.注意定期檢查液氮罐內液氮量 ,及時添加 。
3.4 -20°C 不可超過 1 小時 ,以防止冰晶過大而造成細胞大量死亡 。
3.5 冷凍管內細胞數目一般至少為10*6-7/ml 以上
,凍存細胞健康程度 一般要求活細胞在95%以上
,細胞活力差的在凍存後的成活機率很小
,因此
,一定要在細胞旺盛分裂時期凍存
3.6 細胞凍存管一般有1.5-2ml左右體積
,原則上可以存放1.5ml充滿均勻懸浮細胞的凍存液
,一些人喜歡灌注1-1.5ml凍存液凍存
,這實際上並不好
。
原因如下 :凍存液凍存需要一段時間 ,如果這段時間凍存管傾斜 ,液體容易流到管口 ,很容易在後續的操作中造成汙染 。
建議0.5-1ml之間即可
。但是還是用1.5ml的話
,具體操作時
,凍存管直立起來放在-20的冰箱裏
,這樣不容易造成汙染
。
同時凍存細胞的時候
,一定加上封口膜
,這樣可以避免複蘇的時候,水浴箱裏的水進入蓋子的縫隙中
!
凍存管外麵用封口膜封上後 ,最好再用白膠布再封一下 。
這樣可以防止細胞複蘇時 ,封口膜崩裂 ,水浴箱中的水進入凍存管 。
3.7 提醒;不要將細胞凍存在-4度
,或-20時就忘了
,很心疼
。
小秋建議使用HAKATA無血清細胞凍存液 ,無需程序降溫 ,直凍-80°C冰箱 ,可長期保存達5年。
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