細胞計數

實驗原理 ：當待測細胞懸液中細胞均勻分布時 ，通過測定一定體積懸液中的細胞的數目，即可換算出每毫升細胞懸液中細胞的細胞數目 。

具體操作 ：

一.準備工作 ：    

    取一瓶傳代的細胞 ，按照《傳代細胞培養（消化法）》中的傳代方法繁殖細胞 ，待長成單層後以被使用 。

二.細胞懸液製備 ：

細胞懸液的製備方法是用0.25％的胰蛋白酶液消化 、PBS液洗滌後 ，加入培養液（或Hanks液或PBS等平衡鹽溶液） ，吹打製成待測細胞懸液 。

三.細胞計數 ：

1.蓋好蓋玻片 ：取一套血球計數板，將特製的蓋玻片蓋在血球計數槽上 。

   2.製備計數用的細胞懸液 ：用吸管吸5滴細胞懸液到一離心管中 ，加入5滴台盼藍染液（0.4％）或苯胺黑 ，活細胞不會被染色 ，加入染液後就可以在顯微鏡下區別活細胞和死細胞 。

   3.將細胞懸液滴入計數板 ：將待測細胞懸液吹均勻 ，然後吸取少量懸液沿蓋片邊緣緩緩滴入 ，要保證蓋片下充滿懸液 ，注意蓋片下不要有氣泡 ，也不能讓懸液流入旁邊槽中 。

   4.統計四個大格的細胞數 ：將血球計數板放於顯微鏡的低倍鏡下觀察 ，並移動計數板 ，當看到鏡中出現計數方格後 ，數出四角的四個大鉻（每個大格含有16個中鉻）中沒有被染液染上色的細胞數目 。

   5.計算原細胞懸液的細胞數:按照下麵公式計算細胞密度 ：

（細胞懸液的細胞數）/ml＝          （  四個大格子細胞數/4)         ×2×10⁴ 

說明 ：公式中除以4因為計數了4個大格的細胞數 。

公式中乘以2因為細胞懸液於染液是1 ：1稀釋 。

公式中乘以10⁴因為計數板中每一個大格的體積為 ：

1.0mm（長）×1.0mm（寬）×0.1mm（高）＝0.1mm³ 而 1ml＝1000mm³

四.細胞計數要點 ：

   1.進行細胞計數時 ，要求懸液中細胞數目不低於10⁴個/ml ，如果細胞數目很少要進行離心再懸浮於少量培養液中 ；

   2.要求細胞懸液中的細胞分散良好 ，否則影響計數準確性 。

   3.取樣計數前 ，應充分混勻細胞懸液 ，尤其時多次取樣計數時更要注意每次取樣都要混勻 ，以求計數準確 ；

   4. 數細胞的原則是隻數完整的細胞 ，若細胞聚集成團時 ，隻按照一個細胞計算 。如果細胞壓在格線上時 ，則隻計上線 ，不計下線 ，隻計右線 ，不計左線 。

   5. 操作時 ，注意蓋片下不能有氣泡 ，也不能讓懸液流入旁邊槽中 ，否則要重新計數 。

五.初學者易犯的錯誤 ：

   1. 計數前未將待測懸液吹打均勻 。

   2. 滴入細胞懸液時蓋玻片下出現氣泡 。

   3. 滴入懸液時的量太多 ，至使細胞懸液流入旁邊的槽中 。

六.本實驗特殊試劑的配製 ：

4％台盼藍母液 ：稱取4克台盼藍 ，加入少量蒸餾水研磨 ，加雙蒸水至100毫升 ，用濾紙過濾 ，4℃保存 。

使用液 ：使用時 ，用PBS稀釋母液至0.4％即可 。