細胞傳代培養（消化法）

具體操作 ：

一.  傳代前準備 ：

1.預熱培養用液 ：把已經配製好的裝有培養液 、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴鍋內預熱 。

2.用75％酒精擦拭經過紫外線照射的超淨工作台和雙手 。

3.正確擺放使用的器械 ：保證足夠的操作空間 ，不僅便於操作而且可減少汙染 。

4.點燃酒精燈 ：注意火焰不能太小 。

   5.準備好將要使用的消毒後的空培養瓶 ，放入微波爐內高火 ，8分鍾再次消毒 。

6.取出預熱好的培養用液 ：取出已經預熱好的培養用液 ，用酒精棉球擦拭好後方能放入超淨台內 。

   7.從培養箱內取出細胞 ：注意取出細胞時要旋緊瓶蓋 ，用酒精棉球擦拭顯微鏡的台麵 ，再在鏡下觀察細胞 。

   8.打開瓶口 ：將各瓶口一一打開 ，同時要在酒精燈上燒口消毒 。

二.胰蛋白酶消化 ；

   1.加入消化液 ：小心吸出舊培養液 ，用PBS清洗（衝洗） ，加入適量消化液（胰蛋白酶液） ，注意消化液的量以蓋住細胞最好 ，最佳消化溫度是37℃ 。

   2. 顯微鏡下觀察細胞 ：倒置顯微鏡下觀察消化細胞 ，若胞質回縮 ，細胞之間不再連接成片 ，表明此時細胞消化適度 。

   3.吸棄消化液加入培養液 ：棄去胰蛋白酶液 ，注意更換吸管 ，加入新鮮的培養液 。

三.吹打分散細胞 ：

1.吹打製懸 ：用滴管將已經消化細胞吹打成細胞懸液 。

2.吸細胞懸液入離心管 ：將細胞懸液吸入10ml離心管中 。

3.平衡離心 ：平衡後將離心管放入台式離心機中 ，以1000轉/分鍾離心6-8分鍾 。

    4.棄上清液 ，加入新培養液 ：棄去上清液 ，加入2ml培養液 ，用滴管輕輕吹打細胞製成細胞懸液 。

四.分裝稀釋細胞 ：

    1.分裝 ：將細胞懸液吸出分裝至2-3個培養瓶中 ，加入適量培養基旋緊瓶蓋 。

    2.顯微鏡下觀察細胞 ：倒置顯微鏡下觀察細胞量 ，必要是計數 。注意密度過小會影響傳代細胞的生長 ，傳代細胞的密度應該不低於5×10⁵/ml 。最後要做好標記 。

五.繼續培養 ：

    用酒精棉球擦拭培養瓶 ，適當旋鬆瓶蓋，放入CO₂培養箱中繼續培養 。傳代細胞2小時後開始貼附在瓶壁上 。當生長細胞鋪展麵積占培養瓶底麵積25％時為一個＋ ，占50％為＋＋ ，占75％時為＋＋＋ 。

傳代細胞培養注意事項 ：

   1.嚴格的無菌操作

    2.適度消化 ：消化的時間受消化液的種類 、配製時間 、加入培養瓶中的量等諸多因素的影響 ，消化過程中應該注意培養細胞形態的變化 ，一旦胞質回縮 ，連接變鬆散 ，或有成片浮起的跡象就要立即終止消化 。

附 ：EDTA（0.02％乙二胺四乙酸二鈉）消化液配方 ：

EDTA 0.20g ，NaCl 8.00g ， KCl 0.20g ， KH₂PO₄ 0.02g ， 葡萄糖 2.00g ，0.5％酚紅4ml ，加入蒸餾水定容至1000ml 。10磅20min高壓滅菌 ，使用時調節PH值到7.4 。注意EDTA不能被血清中和 ，使用後培養瓶要徹底清洗 ，否則再培養時細胞容易脫壁