大鼠脂肪幹細胞原代培養幾次都沒有細胞長出 ？

Q:我最近剛入手大鼠脂肪幹細胞的原代培養，按照文獻步驟操作的 ，可是養了幾次都沒有細胞長出 ，我不知道哪一點有問題 ！

另外 ，文獻上都說取大鼠腹股溝皮下脂肪組織 ，為什麽我解剖大鼠時找不到腹股溝皮下脂肪組織啊 ，

是因為我地方弄錯了 ，還是別的原因 。不甚感激 ！我用的0.1%I型膠原酶 ，37°C震蕩消化60min ，80-120 rpm / min ，含10%FBS的低糖DMEM 。
另外 ，I型膠原酶消化完 ，用等體積培養液終止消化離心後（1200rpm/min ，10min） ，沉澱很少 ，感覺大部分脂肪都在頂層 ，這是什麽原因 ，怎麽解決這些問題 ！

A:我覺得這裏有幾個關鍵的問題要注意一下 ：

1.你用的大鼠是多大體重的 ？如果大鼠年齡太老 ，細胞的活性就不好 ，建議用80-100g的大鼠試試 ；

2.腹股溝皮下脂肪組織還是很多的 ，位置在大腿內側與腹部交匯處 ，不知道你是否取的是這個位置的 ；

3.0.1%I型膠原酶 ，37°C震蕩消化60min是可以的 ，不知道你是用什麽容器裝的 ？15ml離心管 ？如果是15ml離心管的話 ，因為脂肪是漂在上麵的 ，所以擴大接觸麵積才能消化到更多的細胞 ，建議你換更大接觸麵的容器試試 。另外 ，取下的脂肪組織應盡可能剪碎 ，原因和前麵相同 ；

4. 80-120 rpm / min ？是不是寫錯了 ？應該是800-1200 rpm / min ，這個轉速時可以的 ；

5. I型膠原酶消化完 ，下麵的沉澱裏就有你要的細胞 ，你既然能夠看得到沉澱 ，說明還是有細胞的 ，大部分的脂肪因為密度低肯定會漂在頂層 ；

6.另外 ，無菌原則要注意做到位 ，這很重要 ，要準備至少兩套手術器械 ，一套取材用 ，一套剪碎脂肪組織用 ，取材時 ，剪開皮膚的剪刀和夾皮膚用的鑷子等 ，不能用來夾和剪皮下的脂肪 ，避免汙染 ；

7.首次換液的時候 ，盡量避免用力晃動瓶子 ，而且首次換液建議不用PBS漂洗 ，吸取原培養基後 ，直接加新培養基 。

最後祝實驗順利 ！