細胞凍存注意事項

      細胞凍存

      方法:

      凍存液最好現配:按1 :3 :6(或1 :2: 7 )配凍存液1份DMSO3份血清和6份培養基

      (養細胞時用什麽培養基凍存時就用什麽培養基) 。取生長狀態量好的細胞進行凍存處理 ，

      對於貼壁細胞:

      1吸出舊培養液加PBS衝洗- -次

      2胰酶消化

      3加培養基中止消化,有的細胞是加血清中止

      4離心收集細胞,不同細胞離心率不一樣(以上僅為貼壁細胞,懸浮細胞收集就用第四部)

      5吸出離心管上清液,加1ML的凍存液重懸細胞,移到凍存管,放4度半小時,-20度兩小時, -80度過夜,再放液氮長期保存

      懸浮細胞:直接離心收集, PBS洗滌

注意事項:
Q錯誤的時機:
細胞狀態不好(長的太過了,培養液已經很黃;細胞可疑汙染;細胞已經開始凋亡或崩解;
連續培養超過二個月,細胞性狀已有改變改變) 。

解決:
最佳時機:細胞增殖旺盛,情況穩定,試驗效果良好,複蘇後兩周內 。
Q細胞太少:
凍存時細胞濃度低於1-5x 1000,000/ml 。( 複蘇很難成功) 。
解決:
離心後調整細胞濃度 。( 不要重新洗細胞) 。
Q蓋子不緊:
凍存管的蓋子一定要擰緊,否則複蘇水浴時會滲水,造成汙染 。
解決:
選擇原配的管子和蓋子(不同牌子/型號的顏色會有差別) 。

Q單薄的凍存盒:

放在-80度的凍存盒,壁太薄,細胞在被迅速降溫 。

解決:
選擇厚壁泡沫塑料盒,或塞入大量幹棉花 。( 凍存的原則:緩降! )

Q -80度太久:
放在-80度冰箱的時間超過半年 。(冰箱的溫度難以恒定:開門/關門,電壓不穩等)
解決:

盡快轉入液氮 。

      1.液氮不足:

      液麵不能漫過所有細胞 。

      解決:

      定期測量液氮儲備,保證細胞全部浸在液麵下 。

      1.取錯細胞:

      找不到/拿錯凍存管 。

      解決:

      每支凍存管都標上細胞的名稱,凍存時間,並記錄在冊 。

      二 、細胞複蘇:

      方法:

      1.從液氮容器中取出凍存管,直接浸入37°C溫水中,並不時搖動令其盡快融化 。

      2.從37°C水浴中取出凍存管,打開蓋子,用吸管吸出細胞懸液,加到離心管並滴加10倍以上培養液,混勻;

      3.離心，1000rpm , 5min ;

4.棄去上清液 ，加入含10%小牛血清培養液重懸細胞,計數,調整細胞密度,接種培養瓶 ，37°C培養箱靜置培養;

4. 5.次日更換一次培養液,繼續培養 。

      注意事項:

Q取錯細胞:

      拿錯凍存管。( 快快快,匆忙之中,難免出錯,況且-170多度,凍手! )

      解決:

      ( 1 )核查記錄冊及凍存管上細胞的名稱 、時間是否一致 。

      (2)拿紙胞時戴手套!

Q水浴時間太長:
      2min還沒融化 。( 凍存管的壁較厚,隔熱)

      解決:

      ( 1 )適當提高水浴溫度(37度-40度) 。

      (2 )要是冬天,就選用保溫盒。

Q冰盒內時間太長:
      複蘇1h後 ，還沒有加入新的培養液 。( 高濃度DMSO防止胞內形成冰晶,凍存時保護細

      胞,但複蘇融解後,浸泡時間太久會,對紅胞有毒性)

      解決:提前預定超淨台, 減少複蘇後插在冰盒裏等待的時間 。

Q.失去耐心:
複蘇三四天後,細胞沒有任何動靜,認為失敗,倒掉所有細胞 。( 有些細胞複蘇後一兩個星期才有起色)
解決:不要換液,耐心等待,兩周後再做決定 。