目前 ，長期保存細胞的方法是將細胞冷凍在液氮（-196℃) 中 ，液氮可以保存一年甚至幾年 。解凍後 ，大多數細胞仍能生長繁殖 。為了適當起見 ，細胞應在冷凍一年後進行冷凍 ，然後再進行冷凍保存 。凍結細胞時 ，應加入保護劑 ，否則 ，細胞內外的水會形成冰晶 ，從而對細胞造成機械損害 。加入保護劑後，可降低冰點 。在緩慢凍結的條件下 ，細胞內的水在凍結前滲出 ，以避免冰晶的破壞 。目前 ，甘油和二甲基亞碸（DMSO) 對細胞無毒 ，分子量小 ，易於穿透細胞 。甘油濃度為 10%≤20% ，二甲基亞碸 5%≤15% ，常用 10% 。此外 ，還應在培養基中添加冷凍液 ，以提供營養 、滲透壓和 pH 值 。細胞複蘇是指冷凍細胞的再培養 。快速解凍細胞 ，使其通過最脆弱的細胞在 -5℃ 。

實驗材料對數生長期細胞

試劑 ，試劑盒消化液培養基 ，甘油 DMSO 酒精水

GB/T1397-1988 儀器 、消耗品秸稈離心管冷凍管培養瓶標記筆紗小口袋溫度計砂輪

實驗步驟

I. 細胞的冷凍保存

1. 細胞懸液的製備

選擇對數細胞 ，10 毫升培養瓶麵 ，幾乎單層可冷凍一管 ；24 小時前 ，液體變化 ，收集細胞 ；按傳代法製作細胞懸液。

二 。細胞收集

細胞懸液進入無菌離心管 ，每分鍾 1000 轉 ，離心 5 分鍾 ，取血清 。

3. 冷凍液體

將培養基和甘油按 9 ：1.1~1.5ml 的比例放入 10% 的冷凍保存液中 ，放入離心管中 ，輕輕吹入細胞懸液中 。

4. 裝瓶

用吸管吸收 1.5 毫升的細胞懸液，並盡可能將其放入瓶中 ，使液體不接觸瓶口 。

5. 印章

把瓶子封在火焰最熱的部位 ，例如用冷藏箱管把蓋子擰緊 。

6. 標記

標記單元格名 ，並在當月的那天將其凍結 。

7. 凍結和保存

安全瓶放置在紗布袋中 ，4℃ ，2 小時 ，-20℃ ，2 小時 。液氮氣相浸泡在 -130℃~-180℃的液氮中 。液氮量必須足以維持溫度不變 。

二 。細胞複蘇

1. 用大鑷子取出瓶子 ，37°42℃放入水中 ，不時搖勻 ，使瓶子能迅速通過 -5°0℃ 。

2. 在超淨台上 ，用砂輪擦拭瓶頸 ，用酒精棉球消毒 ，打開瓶 ，將細胞懸液吸入培養瓶 ，稀釋 10× ，放入二氧化碳孵化器 ，隔天用新鮮培養基代替冷凍保鮮劑 。

目前 ，長期保存細胞的方法是將細胞冷凍在液氮（-196℃) 中 ，液氮可以保存一年甚至幾年 。解凍後 ，大多數細胞仍能生長繁殖 。為了適當起見 ，細胞應在冷凍一年後進行冷凍 ，然後再進行冷凍保存 。凍結細胞時 ，應加入保護劑 ，否則 ，細胞內外的水會形成冰晶 ，從而對細胞造成機械損害 。加入保護劑後 ，可降低冰點 。在緩慢凍結的條件下 ，細胞內的水在凍結前滲出，以避免冰晶的破壞 。目前 ，甘油和二甲基亞碸（DMSO) 對細胞無毒 ，分子量小 ，易於穿透細胞 。甘油濃度為 10%≤20% ，二甲基亞碸 5%≤15% ，常用 10% 。此外 ，還應在培養基中添加冷凍液 ，以提供營養 、滲透壓和 pH 值 。細胞複蘇是指冷凍細胞的再培養 。快速解凍細胞 ，使其通過最脆弱的細胞在 -5℃ 。

實驗材料對數生長期細胞

試劑 ，試劑盒消化液培養基 ，甘油 DMSO 酒精水

GB/T1397-1988 儀器 、消耗品秸稈離心管冷凍管培養瓶標記筆紗小口袋溫度計砂輪

實驗步驟

I. 細胞的冷凍保存

1. 細胞懸液的製備

選擇對數細胞 ，10 毫升培養瓶麵 ，幾乎單層可冷凍一管 ；24 小時前 ，液體變化 ，收集細胞 ；按傳代法製作細胞懸液 。

二 。細胞收集

細胞懸液進入無菌離心管 ，每分鍾 1000 轉 ，離心 5 分鍾 ，取血清 。

3. 冷凍液體

將培養基和甘油按 9 ：1.1~1.5ml 的比例放入 10% 的冷凍保存液中 ，放入離心管中 ，輕輕吹入細胞懸液中 。

4. 裝瓶

用吸管吸收 1.5 毫升的細胞懸液 ，並盡可能將其放入瓶中 ，使液體不接觸瓶口 。

5. 印章

把瓶子封在火焰最熱的部位 ，例如用冷藏箱管把蓋子擰緊 。

6. 標記

標記單元格名 ，並在當月的那天將其凍結 。

7. 凍結和保存

安全瓶放置在紗布袋中 ，4℃ ，2 小時 ，-20℃ ，2 小時 。液氮氣相浸泡在 -130℃~-180℃的液氮中 。液氮量必須足以維持溫度不變 。

二 。細胞複蘇

1. 用大鑷子取出瓶子 ，37°42℃放入水中 ，不時搖勻 ，使瓶子能迅速通過 -5°0℃ 。

2. 在超淨台上 ，用砂輪擦拭瓶頸 ，用酒精棉球消毒 ，打開瓶 ，將細胞懸液吸入培養瓶 ，稀釋 10× ，放入二氧化碳孵化器 ，隔天用新鮮培養基代替冷凍保鮮劑 。

目前 ，長期保存細胞的方法是將細胞冷凍在液氮（-196℃) 中 ，液氮可以保存一年甚至幾年 。解凍後 ，大多數細胞仍能生長繁殖 。為了適當起見 ，細胞應在冷凍一年後進行冷凍 ，然後再進行冷凍保存 。凍結細胞時 ，應加入保護劑 ，否則 ，細胞內外的水會形成冰晶 ，從而對細胞造成機械損害 。加入保護劑後 ，可降低冰點 。在緩慢凍結的條件下 ，細胞內的水在凍結前滲出 ，以避免冰晶的破壞。目前 ，甘油和二甲基亞碸（DMSO) 對細胞無毒 ，分子量小 ，易於穿透細胞 。甘油濃度為 10%≤20% ，二甲基亞碸 5%≤15% ，常用 10% 。此外，還應在培養基中添加冷凍液 ，以提供營養 、滲透壓和 pH 值 。細胞複蘇是指冷凍細胞的再培養 。快速解凍細胞 ，使其通過最脆弱的細胞在 -5℃ 。

實驗材料對數生長期細胞

試劑 ，試劑盒消化液培養基 ，甘油 DMSO 酒精水

GB/T1397-1988 儀器、消耗品秸稈離心管冷凍管培養瓶標記筆紗小口袋溫度計砂輪

實驗步驟

I. 細胞的冷凍保存

1. 細胞懸液的製備

選擇對數細胞 ，10 毫升培養瓶麵 ，幾乎單層可冷凍一管 ；24 小時前 ，液體變化 ，收集細胞 ；按傳代法製作細胞懸液 。

二 。細胞收集

細胞懸液進入無菌離心管 ，每分鍾 1000 轉，離心 5 分鍾 ，取血清。

3. 冷凍液體

將培養基和甘油按 9 ：1.1~1.5ml 的比例放入 10% 的冷凍保存液中 ，放入離心管中 ，輕輕吹入細胞懸液中 。

4. 裝瓶

用吸管吸收 1.5 毫升的細胞懸液 ，並盡可能將其放入瓶中 ，使液體不接觸瓶口 。

5. 印章

把瓶子封在火焰最熱的部位 ，例如用冷藏箱管把蓋子擰緊 。

6. 標記

標記單元格名 ，並在當月的那天將其凍結 。

7. 凍結和保存

安全瓶放置在紗布袋中，4℃ ，2 小時 ，-20℃ ，2 小時 。液氮氣相浸泡在 -130℃~-180℃的液氮中 。液氮量必須足以維持溫度不變 。

二 。細胞複蘇

1. 用大鑷子取出瓶子 ，37°42℃放入水中 ，不時搖勻 ，使瓶子能迅速通過 -5°0℃ 。

2. 在超淨台上 ，用砂輪擦拭瓶頸 ，用酒精棉球消毒 ，打開瓶 ，將細胞懸液吸入培養瓶 ，稀釋 10× ，放入二氧化碳孵化器 ，隔天用新鮮培養基代替冷凍保鮮劑 。

目前 ，長期保存細胞的方法是將細胞冷凍在液氮（-196℃) 中 ，液氮可以保存一年甚至幾年 。解凍後 ，大多數細胞仍能生長繁殖 。為了適當起見 ，細胞應在冷凍一年後進行冷凍 ，然後再進行冷凍保存 。凍結細胞時 ，應加入保護劑 ，否則 ，細胞內外的水會形成冰晶 ，從而對細胞造成機械損害 。加入保護劑後 ，可降低冰點 。在緩慢凍結的條件下 ，細胞內的水在凍結前滲出 ，以避免冰晶的破壞 。目前，甘油和二甲基亞碸（DMSO) 對細胞無毒 ，分子量小 ，易於穿透細胞 。甘油濃度為 10%≤20% ，二甲基亞碸 5%≤15% ，常用 10% 。此外 ，還應在培養基中添加冷凍液 ，以提供營養 、滲透壓和 pH 值 。細胞複蘇是指冷凍細胞的再培養 。快速解凍細胞 ，使其通過最脆弱的細胞在 -5℃ 。

實驗材料對數生長期細胞

試劑 ，試劑盒消化液培養基 ，甘油 DMSO 酒精水

GB/T1397-1988 儀器 、消耗品秸稈離心管冷凍管培養瓶標記筆紗小口袋溫度計砂輪

實驗步驟

I. 細胞的冷凍保存

1. 細胞懸液的製備

選擇對數細胞 ，10 毫升培養瓶麵 ，幾乎單層可冷凍一管 ；24 小時前 ，液體變化 ，收集細胞 ；按傳代法製作細胞懸液 。

二 。細胞收集

細胞懸液進入無菌離心管 ，每分鍾 1000 轉，離心 5 分鍾 ，取血清 。

3. 冷凍液體

將培養基和甘油按 9 ：1.1~1.5ml 的比例放入 10% 的冷凍保存液中 ，放入離心管中 ，輕輕吹入細胞懸液中 。

4. 裝瓶

用吸管吸收 1.5 毫升的細胞懸液 ，並盡可能將其放入瓶中 ，使液體不接觸瓶口 。

5. 印章

把瓶子封在火焰最熱的部位 ，例如用冷藏箱管把蓋子擰緊 。

6. 標記

標記單元格名 ，並在當月的那天將其凍結 。

7. 凍結和保存

安全瓶放置在紗布袋中 ，4℃ ，2 小時 ，-20℃ ，2 小時 。液氮氣相浸泡在 -130℃~-180℃的液氮中 。液氮量必須足以維持溫度不變 。

二 。細胞複蘇

1. 用大鑷子取出瓶子 ，37°42℃放入水中 ，不時搖勻 ，使瓶子能迅速通過 -5°0℃ 。

2. 在超淨台上 ，用砂輪擦拭瓶頸 ，用酒精棉球消毒 ，打開瓶 ，將細胞懸液吸入培養瓶 ，稀釋 10× ，放入二氧化碳孵化器 ，隔天用新鮮培養基代替冷凍保鮮劑 。

目前細胞凍存多采用甘油或二甲基亞碸作保護劑 ，這兩種物質能提高細胞膜對水的通透性 ，

加上緩慢冷凍可使細胞內的水分滲出細胞外，減少細胞內冰晶的形成 ，從而減少由於冰晶形成造成的細胞損傷 。

複蘇細胞應采用快速融化的方法 ，這樣可以保證細胞外結晶在很短的時間內即融化 ，避免由於緩慢融化使水分滲入細胞內形成胞內再結晶對細胞造成損傷 。

其他細胞培養的傳代及日常維持過程中 ，在培養器具 、培養液及各種準備工作方麵都需大量的耗費 ，

而且細胞一旦離開活體開始原代培養 ，它的各種生物特性都將逐漸發生變化並隨著傳代次數的增加和體外環境條件的變化而不斷有新的變化 。

因此及時進行細胞凍存十分必要 。細胞冷凍儲存在-80℃冰箱中可以保存一年之久 ；細胞儲存在液氮中 ，溫度達-196℃ ，理論上儲存時間是無限的 。