在細胞複蘇過程中 ，有多次複蘇失敗 ，最終在查閱了相關技術積累了足夠的複蘇技能後複蘇成功 ，現將細胞複蘇的操作程序和注意事項總結如下 ，望能為實驗人提供些參考 。

材料
1.常規細胞培養儀器設備 、恒溫水浴振蕩器 。
2.培養液（DMEM）胎牛血清（CBS）二甲基亞碸（DMSO） 。

操作程序
1.細胞實驗室進行常規消毒 ，紫外照射40min以上 。
2.培養液（DMEM） 、0.25％胰蛋白酶（Trypsin）恒溫水浴箱370C預熱20min ，備用 。
3.二甲基亞碸（DMSO)在4度冰箱中冷藏30min ，備用 。
4.從液氮保存罐中取出凍存管 ，立即放入40度水浴中 ，快速搖晃 ，直至凍存液完全融化 。
5.將細胞懸液移入15ml離心管 ，緩慢加入4ml培養液 ，離心（1000r/min ，5min） 。
6.用培養液懸液混懸沉澱細胞 ，調整細胞濃度 ，放培養箱中培養 。
7.記錄複蘇日期 。

注意事項
1. 取細胞的過程中注意帶好防凍手套 ，護目鏡 。此項尤為重要 ，細胞凍存管可能漏入液氮 ，解凍時凍存管中的氣溫急劇上升 ，可導致爆炸 。
2. 凍存液的問題 ：凍存液的配置已是常識 ，在這裏不作詳述 ，但二甲基亞碸（DMSO）對細胞不是完全無毒副作用，在常溫下 ，二甲基亞碸對細胞的毒副作較大 ，因此 ，必須在1-2min內使凍存液完全融化 。如果複蘇溫度太慢 ，會造成細胞的損傷 ，二甲基亞碸（DMSO）最好選擇進口產品 。
3. 離心前須加入少量培養液 。細胞解凍後二甲基亞碸濃度較高 ，注意加入少量培養液可稀釋其濃度 ，以減少對細胞的損傷 。
4. 離心問題 ：目前主要有兩種見解 。一種是解凍後的細胞懸液直接吹打均勻後分裝到培養瓶中進行培養 ，第二天換液 。因為離心的目的是兩個 ，去除DMSO ，去除死細胞 ，這個是標準流程 ，但對一般人來說 ，把握不好離心轉速和時間 ，轉的不夠活細胞沉底的少 ，細胞就全被扔掉了 ，轉過了活細胞會受壓過大 ，死亡。此外在操作過程中容易汙染 ，所以不推薦 。另一種說法為細胞懸液中含有二甲基亞碸（DMSO） ，DMSO對細胞有一定的毒副作用 ，所以須將離心後的液體前倒淨 ，且一定倒幹淨 。我在試驗中按照常規的離心分裝的方法進行複蘇 ，結果無異常 。
5. 細胞貼壁少的問題 ：教科書中說明凍存細胞解凍時1ml細胞液要加10ml－15m培養液 ，而在我的試驗中的經驗總結為培養基越少細胞越容易貼附 。
6. 複蘇細胞分裝的問題 ：試驗中我的經驗總結為複蘇1管細胞一般可分裝到1-2隻培養瓶中 ，分裝過多 ，細胞濃度過低 ，不利於細胞的貼壁 。
7. 加培養基的量放入問題 ：這個量的多少的把握主要涉及到的問題是DMSO的濃度 ，從如果你加培養基的太少 ，那麽DMSO的濃度就會比較大 ，就會影響細胞生長 ，從以前的資料來看 ，DMSO的濃度在小於0.5%的時候對一般細胞沒有什麽影響 ，還有一個說法是1％ 。所以如果你的凍存液的濃度是10％DMSO的話那麽加10ml以上的培養基就恰好稀釋到了無害濃度 。