1.2.冷凍前檢測細胞是否仍保有其特有性質 ，例如雜交瘤細胞應在冷凍保存前一至二日測試是否有抗體之產生 。1.3.注意冷凍保護劑之品質 。DMSO應為試劑級等級 ，無菌且無色 。4℃避光保存 ，勿作多次解凍 。甘油亦應為試劑級等級 ，以高壓蒸汽滅菌後避光保存 。在開啟後一年內使用 ，因長期儲存後對細胞會有毒性 。1.4.冷凍保存之細胞濃度 ： DMSO 的濃度介於 5%~20% 之間 。生長培養液的體積應調整以適於所用細胞保護劑的變化 。1.4.1.正常人成纖維細胞:1-3×106 cells/ml1.4.2.雜交瘤細胞:1-3x106cells/ml ，細胞濃度不要太高 ，某些雜交瘤細胞會因冷凍濃度太高而在解凍24小時後死去 。1.4.3.貼壁的腫瘤細胞係:5-7x106cells/ml ，依細胞種類而異 。腺癌解凍後須較高之濃度 ，而HeLa隻需1-3×106cells/ml 。1.4.4.其他懸浮細胞:5-10× 106cells/ml,humanlymphocyte須至少5×106cells/ml 。1.5.冷凍保護劑濃度為5%或10%DMSO ，若是不確定細胞之冷凍條件 ，在做冷凍保存之同時 ，亦應作一個對照培養 ，以防止冷凍失敗 。+n62.細胞冷凍保存的具體操作2.材料 ：2.1.生長良好之培養細胞2.2.新鮮培養基2.3.DMSO(SigmaD-2650)2.4.無菌塑料冷凍保存管2.5.0.4％ w/v台盼藍2.6.血球計數盤與蓋玻片2.7.等速降溫機(KRYO10SeriesII)3.步驟 ：3.1.冷凍前一日前更換半量或全量培養基 ，觀察細胞生長情形 。3.2.配製冷凍保存溶液(使用前配製) ：將DMSO加入新鮮培養基中 ，最後濃度為5-10％ ，混合均勻 ，置於室溫下待用 。3.3.依細胞繼代培養之操作 ，收集培養之細胞 ，取少量細胞懸浮液(約20ul)計數細胞濃度及凍前存活率 。3.4.離心 ，去除上清液 ，加入適量冷凍保存溶液 ，對應細胞適合的凍存密度混合均勻 ，分裝於已標示完全之冷凍保存管中 ，1ml/管 ，並取少量細胞懸浮液作汙染檢測 。3.5.冷凍保存方法 ：在每一個凍存管上注明細胞係的名字 ，凍存者姓名和凍存時間 ，方便日後尋找 。將一批細胞用橡皮筋捆綁住 ，用足夠多的棉花將凍存管包裹 ，包括燒杯的底座和瓶頂 ，保護細胞逐級冷卻 ，防止過快冷凍產生的冰晶破壞細胞狀態 ，放入-80℃冷凍 ，然後放置於液氮中 。
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