冷凍保存是一種通過防止或最小化損傷來保持細胞和組織的結構和功能的技術 。冷凍保存的細胞和組織可以在極低溫度下在有限的空間內長期儲存 ，並且需要較少的維護[ 1 ] 。幹細胞用於移植和基於細胞的治療 ，這使得這些細胞成為再生和生物醫學研究的有前途的工具 。然而 ，幹細胞具有有限的壽命[ 2 ] ，並與增加的通道的數量 ，它們的增殖能力和分化降低[ 3 ，4] 。胚胎幹（ES）細胞來源於胚泡期胚胎的內細胞團 ，具有自我更新和分化成不同細胞譜係的潛力[ 5 ] 。小鼠ES細胞用於各種研究應用 ，包括基因打靶 ，這有助於生成靶標突變小鼠模型 ，用於功能基因組研究和應用[ 6 ] 。從供體小鼠分離的精原幹細胞（SSCs）在受體小鼠睾丸中重新繁殖並產生成熟的精子[ 7]]。ES細胞和SSCs在低溫保存時的增殖和分化能力的維持可以擴展其在由於化學療法和放射療法的性腺毒性作用而導致不育的癌症患者中的再生療法和恢複生育力的應用[ 6 ] 。
幾種不同來源的已建立的細胞係通常用於藥物測定和基因表達分析[ 8 ] 。各種原代細胞也常規用於生物學研究 。小鼠胚胎成纖維細胞（MEF）細胞用作飼養細胞來維持的ES細胞和誘導的多能幹（iPS）細胞的未分化狀態[ 9 ，10 ] 。外周血單核細胞（PBMCs）通常用於廣泛的傳染病和臨床疫苗研究中的前瞻性表型和功能分析[ 11 ] 。PBMC用於開發有效的人類免疫缺陷病毒1疫苗並推斷效應功能和細胞或體液免疫應答[ 12] 。小鼠骨髓細胞（mBMCs）被用於研究血管生成抑製劑的藥物在癌症治療[ 13，14 ] 。這些細胞在造血幹細胞移植研究[ 15 ]和再生醫學[ 16 ]中具有潛在的應用價值 。每種細胞類型的結構和細胞膜組成不同 ，因為它們對冷凍保存的反應不同 。冷凍和培養過程中的培養年齡也可能影響冷凍成功[ 17 ] 。目前 ，細胞培養方法應用於生物學和醫學的各個領域的廣泛增加強調了對無汙染和有效細胞冷凍保存的需求 。
在冷凍保存期間 ，細胞損傷主要發生在作為重要細胞成分的水在超低溫下凍結時 。通過添加冷凍保護劑（CPA）可以最小化細胞損傷 。二甲基亞碸（DMSO）由於其低毒性而在細胞和組織冷凍保存中被廣泛使用的可滲透的CPA [ 18 ] 。胎牛血清（FBS）是一種常用的非滲透性CPA ，它與DMSO結合用於幾種細胞係和組織 ，因為它支持更好的細胞恢複 。然而 ，需要找到FBS作為冷凍保存劑的替代品 ，因為它很昂貴 。此外 ，收集血液的方法是不人道的 ，因為在屠宰期間通過心髒穿刺從懷孕的牛中取出的牛胎兒采集FBS而不進行任何麻醉[19 ，20 ] 。動物血清的使用還與病毒[ 21 ]和朊病毒汙染以及可能的疾病傳播[ 22 ] 的風險相關 ，其中一些不可能從血清中去除 。一些這些感染劑 ，如細菌和病毒 ，甚至能夠在被常規地用於細胞原液存儲低溫存活的（-160℃）[ 23 ，24 ] 。盡管FBS在生物醫學研究中是不可或缺的 ，但無FBS的cryomedia將通過符合良好的實驗室實踐而使研究人員受益。
已經考慮了幾種低溫血清替代品 。絲膠蛋白是一種富含絲氨酸的蛋白質水解產物 ，在脫膠過程中從生絲中獲得 。已顯示絲膠蛋白在大腸杆菌中的表達可預防冷凍應激並促進細胞活力[ 25 ] 。含有絲膠蛋白冷凍保存的中國倉鼠卵巢（CHO）和P3UI骨髓瘤細胞的培養基與傳統的含FBS培養基一樣有效 ，並優於幾種商業無血清冷凍培養基[ 26 ] 。同樣 ，在低溫介質中用牛血清白蛋白（BSA）替代FBS顯示細胞恢複和外周血單核細胞活力無顯著差異[ 27] 。然而 ，絲膠蛋白和BSA的極高成本限製了它們的使用 ，特別是在發展中國家 。
單獨使用牛眼液（BOF）以及與綿羊血漿和人血清白蛋白的組合已被評估為不同細胞的血清替代物[ 28 ] 。BOF有幾種促進細胞生長的活性成分 ，如血管內皮生長因子[ 29 ] ，21-KDa酸性鈣結合蛋白[ 30 ] ，胰島素樣生長因子 ，次黃嘌呤和纖維連接蛋白[ 31 ]; 但是 ，它本身不支持細胞生長 。此外 ，眼液中含有多種蛋白質 ，包括白蛋白[ 32] ，可以作為非滲透性注冊會計師 。收集水牛眼液（BuOF）在印度是可行的 ，因為沒有關於水牛屠宰的宗教禁忌 ，並且水牛眼可作為屠宰場副產品大量供應 。BuOF的價格比FBS的價格低7-8倍（在印度情景中） ，因為眼睛是封閉的器官 ，因此無法收集BuOF 。然而 ，迄今尚未評估BuOF對細胞冷凍保存的影響 。
本研究的目的是評估BuOF是否可以代替FBS進行細胞冷凍保存 。尊龍凱時還評估了BuOF的組成 ，以確定可能在賦予冷凍保護能力方麵起關鍵作用的組分 。
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所有動物程序均由印度海德拉巴的細胞和分子生物學中心（CCMB）的動物倫理委員會（IAEC）批準 。從印度海德拉巴市的Slaughter House收集來自健康Murrah雄性小牛（n = 12;年齡 ，6-8個月）的完整眼球 ，並在冰上用磷酸鹽緩衝鹽水（PBS; Invitrogen）轉運 。在屠宰後1小時內到達實驗室後 ，從眼球中修剪出眼肌和視神經 。用冰冷的50％乙醇和PBS衝洗幾次後 ，用22號針頭小心地刺破眼球的角膜 ，並收集房水 。然後使用無菌手術刀切開眼球的後房 ，並使用10-ml注射器收集玻璃體液 。g（在4℃下15分鍾） ，然後通過0.45-μm和0.22-μm過濾器過濾 。將無菌BuOF等分到冷凍管（Nunc）中並在-30℃下儲存直至使用 。
BuOF和FBS的生化組成的差異由醫學診斷機構（Vijaya Diagnostics; www.vijayadiagnostic.com）確定 。每個用於FBS（Gibco;來源 ，美國;批號;分別為494515,816712和835987）和合並的BuOF的總共三個樣品用於分析 。每種分析的生物化學的平均值和用於分析的方法列於表1中 。
BuOF和FBS的比較生化分析 。
參數（mg / dl） | 用於分析的方法 | BuOF | FBS | |
1 | 總蛋白質 | 雙縮脲 | 0.5±0.03 | 3.25±0.23 |
2 | 白蛋白 | 溴甲酚綠（BCG） | 0.2±0.09 | 1.85±0.32 |
3 | 球蛋白 | Biuret和BCG | 0.3±0.01 | 1.4±0.2 |
4 | 脂蛋白A. | 粒子增強免疫比濁法 | 1.8±0.1 | 2.5±0.2 |
五 | 甘油三酯 | 甘油-3-磷酸氧化酶 - 苯酚氨基苯醌（GPO-PAP）比色法 | 13±0.9 | 61±1.4 |
6 | 總膽固醇 | （膽固醇氧化酶 - 過氧化物酶）同位素稀釋（CHO-POD）IDMS質譜 | 22.5±1 | 27.5±1.02 |
7 | 低密度脂蛋白膽固醇 | 酶促免疫抑製 | 14±0.9 | 8±0.8 |
8 | HDL膽固醇 | （總膽固醇） - （HDL + VLDL膽固醇） | 6±0.7 | 8±0.6 |
9 | VLDL膽固醇 | （TG / 5） | 2.6±0.5 | 12.5±0.8 |
10 | 葡萄糖 | 己糖激酶 | 56.5±2.3 | 77±4.1 |
11 | 抗壞血酸 | 分光光度法 | 7.27±0.7 | 1.13±0.2 |
值以平均值±SEM表示 。
IAEC批準從小鼠中獲得細胞（許可證號為IAEC 52/2014和4/2015） 。為了分離人外周血單核細胞（hPBMC） ，獲得了印度海得拉巴CCMB的機構倫理委員會（IEC）的批準（許可證號為IEC 35/2015） 。除非另有說明 ，否則所有試劑均購自Invitrogen 。細胞係包括中國倉鼠卵巢細胞（CHO-K1ATCC ，CCL-61） ，小鼠胚胎幹（mES）細胞-R1（ATCC ，SCRC-1011）和人胚腎細胞（HEK-293T / 17ATCC ，CRL-11268）購自美國典型培養物保藏中心（ATCC） 。永生化C18-4小鼠A型精原細胞係[ 33]是Marie-Claude Hofmann博士（德克薩斯大學MD安德森癌症中心 ，美國德克薩斯州休斯頓）的禮物 。在獲得書麵同意後 ，如前所述[ 27 ]從任一性別的健康誌願者收集的血液中分離人PBMC （n = 9） 。如前所述 ，MEF細胞[ 34 ]和mBMCs [ 35 ]均來自C57BL / 6小鼠（n = 6） 。所有貼壁細胞在具有高葡萄糖和懸浮細胞的Dulbecco改良的Eagle培養基（DMEM）中在Roswell Park Memorial Institute（RPMI）1640培養基中培養 。兩種培養基均補充10％熱滅活的FBS ，1×非必需氨基酸溶液和1×抗生素 - 抗真菌溶液 ，細胞在5％CO 2中培養 。環境溫度為37°C 。培養24小時後新鮮的融合貼壁細胞和72小時培養後的新鮮懸浮細胞被認為是對照組 。
不受控製的慢速冷凍方案用於細胞冷凍保存 。用於冷凍的Cryomedia由DMEM / F12-HEPES組成 ，其僅含有10％DMSO（Sigma）（D10）和20％FBS（v / v）（D10S20）或20％BuOF（v / v）（D10O20） 。在每個2ml冷凍管中 ，將細胞懸浮液（1×10 7個細胞）加入1ml低溫培養基中並在冰上平衡30分鍾 。將冷凍管置於異丙醇容器（Mr.Frosty Freezing Container; Thermo Scientific）中並保存在-80℃冰箱（Thermo Scientific）中 。按照製造商的方案 ，以約1℃/ min的不受控製的速率冷卻細胞 。24小時後 ，將冷凍管轉移至液氮中儲存 。
1個月後 ，通過將冷凍管在37℃水浴中旋轉直至內容物完全熔化來解凍細胞 。將解凍的內容物轉移到含有10ml補充有10％FBS的DMEM / F12-HEPES的15ml管中 。輕輕混合試管中的內容物 ，以200× g離心5分鍾 ，並將細胞沉澱物懸浮於DMEM /高葡萄糖或含有10％FBS的RPMI 1640培養基中，這取決於細胞類型 。在接種培養細胞之前測定細胞活力 。
在解凍後和培養24小時（貼壁細胞）和72小時培養（懸浮細胞）後立即評估細胞活力 。通過台盼藍染料（Sigma）排除分析測定細胞活力 。在孵育結束後不遲於10分鍾進行顯微鏡評估 。計數約500個細胞/組用於細胞活力分析 。
對於細胞回收測定 ，根據每組中的解凍後存活率接種細胞 。使用上述培養基和培養條件 ，以2×10 5活細胞/ cm 2的密度 ，在100-mm培養皿和懸浮細胞中 ，在75-mm 2培養瓶（均來自TPP）中培養貼壁細胞 。24小時後 ，用PBS洗滌粘附的細胞兩次 ，並通過胰蛋白酶（0.25％）消化收獲細胞 。培養72小時後 ，通過以200× g沉澱5分鍾收集懸浮細胞 。評估回收的細胞的存活率並計數以估計每個冷凍保存組中的細胞恢複[ 27 ] 。
將培養24小時的冷凍解凍的貼壁細胞和培養72小時的懸浮細胞評估凋亡和細胞增殖特異性蛋白的表達 。通過在溶解緩衝液（7M尿素 ，2M硫脲 ，4％CHAPS [3 - [（3-膽酰胺丙基）二甲基氨基] -1-丙磺酸鹽] ，18mM Tris-HCl ，14mM Tris-Base ，0.2中超聲處理均質化提取總蛋白質 。 ％Triton-X和50mM二硫蘇糖醇） 。在蛋白質提取之前 ，將單一強度的ProteCEASE-50（一種不含乙二胺四乙酸（EDTA）的蛋白酶抑製劑（G-Biosesciences））加入到溶解緩衝液中 。將裂解的樣品（30μg）進行12％十二烷基硫酸鈉（SDS） - 聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE） 。將凝膠轉移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（Millipore）上 。用起始塊（TBS）封閉緩衝液（Life Technologies）在室溫下封閉膜1小時 。所有一抗和二抗均購自Thermo Scientific ，無論是否另有說明 。將封閉的膜與下列一抗孵育 ，以評估早期凋亡蛋白Annexin V ，1 ：1000（Santa Cruz Biotechnology）的表達; 細胞增殖蛋白 ，增殖細胞核抗原（PCNA） ，1 ：1000; 促凋亡蛋白 ，BCL2相關X蛋白（BAX） ，1 ：200; 和抗凋亡蛋白 ，B細胞淋巴瘤2（BCL2） ，1 ：1000 。為了控製凝膠上的蛋白質負載 ，用甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH） ，1 ：1000抗體探測膜 。然後用TBS-T洗滌膜，並在山羊抗小鼠或山羊抗兔HRP-綴合的二抗（1 ：10000）在TBS中在室溫下孵育1小時 。在用TBS-T洗滌後 ，使用針對Super Signal West Femto化學發光底物（Thermo Scientific）的C-DiGit印跡掃描儀（Licor）通過化學發光揭示免疫反應性 ，並使用光密度計分析產生的信號 。對於每個冷凍保存組 ，將來自每種抗體的信號標準化為GAPDH的信號 。
使用溶解緩衝液（7M尿素 ，2M硫脲 ，4％CHAPS ，18mM Trizma堿，2片EDTA蛋白酶抑製劑 ，0.2％Triton X和50mM DTT）提取來自BuOF和FBS樣品的總蛋白質 。然後使用酰胺黑測定法對提取的蛋白質進行定量[ 36] 。將2×10％的每種樣品置於2×lamelli緩衝液（20％甘油 ，4％SDS ，10％2-巰基乙醇 ，0.004％溴酚藍和0.125M Tris HCl）中 ，一式兩份進行12％SDS-PAGE 。將凝膠在CBB R-250（考馬斯亮藍R-250; Bio Rad）中染色過夜 ，然後去染色並記錄 。將每個電泳的樣品泳道分成五個部分 ，並將每個部分進一步加工成更細的1.5mm片 。將各級分在40mM碳酸氫銨的50％乙腈（ACN）中洗滌1次 ，每次用水洗滌1小時 ，然後用100％ACN脫水 。然後用40μl測序級胰蛋白酶（10ng /μl; Promega）消化每個級分18小時。使用在50％ACN中的0.1％三氟乙酸（TFA）提取消化的肽（100μl） 。合並每個餾分的各個樣品 ，脫鹽 ，然後真空幹燥 。然後將肽在20μl的5％ACN和0.1％的甲酸中重構 。使用Orbitrap Nano分析儀（Thermo Scientific）對胰蛋白酶消化的肽進行串聯質譜（MS / MS） 。樣品以碰撞誘導的解離模式一式兩份運行1小時 。從獲得的MS / MS峰列表中鑒定出蛋白質Bos taurus數據庫 。
從每個試驗中匯集數據用於分析 。結果表示為每組細胞類型的四次試驗的平均值±SEM 。使用方差分析（ANOVA）進行統計分析 。通過用Fisher's最小重要性差異（LSD）測試分析數據來確定平均值之間的顯著差異 。顯著性水平設定為P <0.05 。
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BuOF和FBS的生化組成如表1所示 。除了低密度脂蛋白（LDL）膽固醇和抗壞血酸（其中BuOF較高）外 ，大多數成分在FBS中高出數倍 。
在解凍後立即通過台盼藍染料排除測定細胞的活力（圖1A） 。在D10中冷凍的所有三種貼壁細胞係 ，mES細胞 ，hPBMC ，mBMC和MEF細胞中的細胞解凍後存活率顯著低於在D10S20和D10O20中冷凍的新鮮細胞和細胞 。在D10O20中冷凍的C18-4細胞 ，HEK細胞 ，mES細胞 ，hPBMC和mBMC的存活率顯著低於新鮮細胞 ，但與在D10S20中冷凍的細胞相似 。然而 ，在D10O20中冷凍的CHO細胞的活力類似於在D10S20中冷凍的新鮮細胞和細胞的活力 。在D10O20中冷凍的MEF細胞的活力顯著低於在D10S20中冷凍的新鮮細胞和細胞的活力 。
新鮮和冷凍 - 解凍細胞中的細胞活力和細胞恢複 。
（A）解凍後立即通過台盼藍染料排除測定的新鮮和冷凍 - 解凍細胞的細胞活力 。（B）24小時（MEF ，C18-4 ，CHO ，HEK和mES細胞）和72小時（hPBMC和mBMC）培養物後冷凍 - 解凍細胞的細胞回收百分比 。（C）在24小時（MEF，C18-4 ，CHO ，HEK和mES細胞）和72小時（hPBMC和mBMC）培養後通過台盼藍染料排除測定的細胞活力 。數據代表尊龍凱時對每組中每種細胞類型的試驗的平均值±SEM 。具有不同字母的條在P <0.05時顯著不同 。
評估培養後72小時的凍融貼壁細胞24小時和懸浮細胞以確定細胞恢複（圖1B） 。無論細胞類型如何 ，D10的細胞恢複均顯著下降; 然而 ，在所有三種貼壁細胞係 ，mES細胞 ，hPBMC和mBMC中 ，D10S20和D10O20的細胞恢複相似 。在D10O20中冷凍的C18-4細胞的回收也與新鮮細胞的回收相似 。與新鮮細胞相比 ，D10S20和D10O20中回收的MEF細胞較少 ，與D10S20相比 ，在D10O20中回收的細胞較少 。
培養後還測定了所有細胞類型的細胞活力（圖1C） 。C18-4 ，HEK和mES細胞的活力與包括D10在內的所有冷凍保存組中的新鮮細胞的活力相似 。在D10中冷凍的MEF細胞 ，CHO細胞 ，hPBMC和mBMC的存活率顯著低於在D10S20和D10O20中冷凍的新鮮細胞和細胞的活力 。在D10O20中冷凍的hPBMC和mBMC的存活率顯著低於新鮮細胞 ，但與在D10S20中冷凍的細胞相似 。
在培養後在冷凍 - 解凍的細胞中分析細胞增殖 ，早期凋亡 ，促凋亡和抗凋亡特異性蛋白（分別為PCNA ，膜聯蛋白V ，BAX和BCL2）的表達水平（圖2A） 。在D10中冷凍保存的所有細胞類型中的PCNA表達低於新鮮細胞中的PCNA表達 ，並且在D10S20和D10O20中冷凍保存的細胞（圖2B）） 。在D10O20中冷凍的CHO細胞 ，hPBMC和mES細胞中的PCNA表達類似於在D10S20中冷凍的新鮮細胞和細胞的PCNA表達 。在D10O20中冷凍的hPBMC和C18-4細胞中的PCNA表達與在D10S20中冷凍但低於在新鮮細胞中冷凍的那些細胞相似 。在MEF細胞中 ，在D10O20中冷凍的細胞中的PCNA表達低於在D10S20中冷凍保存的新鮮和細胞中的PCNA表達 。有趣的是 ，在D10O20中冷凍的HEK細胞中的PCNA表達與新鮮細胞相似 ，但高於在D10S20中冷凍的細胞中的PCNA表達 。
圖2
在凍融細胞中表達增殖 ，促凋亡 ，抗凋亡和早期凋亡特異性蛋白 。
在24小時（MEF ，C18-4 ，CHO ，HEK和mES細胞）和72小時（hPBMC和mBMC）培養物後 ，細胞PCNA ，BAX ，BCL2和膜聯蛋白V分別在新鮮和冷凍 - 解凍的細胞中表達 。將每種細胞提取物的30微克等分試樣進行SDS-PAGE和蛋白質印跡分析 。（A）（B）BAX / BCL2比例 ，（C）PCNA和（D）膜聯蛋白V相對於GAPDH的表達的代表性蛋白質印跡和光密度分析 。數據代表尊龍凱時對每組細胞類型的試驗的平均值±SEM 。具有不同字母的條在P <0.05時顯著不同 。
在D10中冷凍的所有細胞類型中BAX / BCL2蛋白的比例顯著高於新鮮細胞和在D10S20和D10O20中冷凍保存的細胞（圖2C） 。盡管與新鮮細胞相比 ，D10O20中的BAX / BCL2比率更高 ，但是除了mBMC之外 ，其在所有細胞類型中與D10S20中冷凍的細胞相似 。與在D10S20中冷凍的那些相比 ，在D10O20中冷凍的mBMC具有更高的BAX / BCL2比率 。在D10中冷凍保存的所有七種細胞類型中膜聯蛋白V蛋白的表達高於新鮮細胞 ，並且在D10S20和D10O20中冷凍保存的細胞（圖2D）） 。MEF細胞中的膜聯蛋白V表達和在D10O20中冷凍的hPBMC類似於在D10S20中冷凍的新鮮細胞和細胞的表達 。在D10O20中冷凍的C18-4細胞 ，HEK細胞 ，CHO細胞 ，mES細胞和mBMC中的膜聯蛋白V表達與在D10S20中冷凍但低於新鮮細胞的細胞相似 。
通過耗盡豐富蛋白質的樣品並對樣品進行MS / MS分析來進行BuOF和FBS的蛋白質組學分析 。基於Bos taurus數據庫中的MS / MS峰搜索，鑒定了BuOF中的41種蛋白質和FBS中的207種蛋白質 ，其中16種是常見的 。在BuOF中鑒定的蛋白質列表及其與FBS的比較顯示在表2中 。在FBS中鑒定的蛋白質列於S1表中 。蛋白質數據庫檢索和文獻檢索顯示 ，BuOF含有26％的糖蛋白 ，9％的球狀蛋白 ，7％的血漿蛋白 ，9％的脂蛋白和7％的細胞骨架蛋白 。在16種常見蛋白中 ，白蛋白是FBS和BuOF中鑒定的主要蛋白質 。
BuOF蛋白質組學分析及與FBS的比較 。
蛋白質的名稱 | 分子量（kDa） | 蛋白質類型/作用 | 無論是在FBS還是在場 | |
1 | 載脂蛋白AI前體 | 30.3 | 高密度脂蛋白/促進細胞增殖和抑製細胞凋亡[ 77 ] | 當下 |
2 | 纖連蛋白可變區 | 20.4 | 糖蛋白/誘導細胞增殖 ，抑製細胞凋亡[ 83] ，並有助於提高冷凍保存精子的生育率[84 ] | 當下 |
3 | 運甲狀腺素蛋白前體 | 15.7 | 甲狀腺素結合前白蛋白 | 當下 |
4 | 血清白蛋白 | 53.9 | 球狀蛋白/替代血清有效冷凍保存PBMC細胞[ 27 ] | 當下 |
五 | α-1-B糖蛋白前體 | 53.5 | 糖蛋白 | 當下 |
6 | 凝 | 80.7 | 溶血磷脂酸轉運蛋白/抗氧化特性[ 73 ]並參與細胞凋亡的控製和執行[ 72 ] | 當下 |
7 | 補充部分3 | 187.1 | 糖蛋白 | 當下 |
8 | 角蛋白5 ，II型 | 62.6 | 細胞骨架蛋白 | 當下 |
9 | 間α-胰蛋白酶抑製劑重鏈H2前體 | 106.1 | 載體蛋白 | 當下 |
10 | 白蛋白 | 69.2 | 球狀蛋白/替代sserum有效冷凍保存PBMC細胞[ 27 ] | 當下 |
11 | 補體因子B前體 | 85.3 | 循環蛋白 | 當下 |
12 | 角蛋白7 ，II型 | 50 | 細胞骨架蛋白 | 當下 |
13 | 轉鐵蛋白同種型X1 | 77.6 | 糖蛋白/主要抗氧化蛋白和保護精子免受凍融過程中的氧化損傷[ 69 ] | 當下 |
14 | 角蛋白42 ，類型1喜歡異構體X3 | 50.3 | 細胞骨架蛋白 | 當下 |
15 | Serpin肽酶抑製劑，進化枝A（α-1抗蛋白酶 ，抗胰蛋白酶） ，成員1異構體X1 | 46.1 | 通過抑製caspase-3來抑製酶/抑製細胞凋亡[ 75 ] | 當下 |
16 | BSA鏈的晶體結構b | 66.4 | 球狀蛋白/替代血清有效冷凍保存PBMC細胞[ 27 ] | 當下 |
17 | α-2-HS-糖蛋白前體 | 38.4 | 糖蛋白 | 缺席 |
18 | Serpin肽酶抑製劑 ，進化枝A（α-1抗蛋白酶 ，抗胰蛋白酶） ，成員3 | 22.7 | 球蛋白糖蛋白/通過抑製caspase-3抑製細胞凋亡[ 75 ] | 缺席 |
19 | Regucalcin | 33.3 | 鈣結合蛋白/維持細胞穩態和在許多細胞類型的細胞信號係統中作為抑製蛋白的作用[ 81 ] | 缺席 |
20 | 牛因子Vai的晶體結構 ，鏈A. | 34.7 | 因子Va的滅活形式 | 缺席 |
21 | 內啡肽2C | 46.7 | 因此 ，serpin /抑製半胱氨酸蛋白酶和彈性蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶的類型最終會抑製細胞凋亡[ 85 ] | 缺席 |
22 | 胎球蛋白B前體 | 42.6 | 糖蛋白/抗氧化劑 ，通過增加ROS清除酶幫助維持精子形態[ 82 ] | 缺席 |
23 | 纖維蛋白原α鏈 | 18.1 | 糖蛋白 | 缺席 |
24 | 載脂蛋白E | 27.1 | 脂蛋白 | 缺席 |
25 | C型凝集素結構域家族3 ，成員B前體 | 22.1 | 纖溶酶原結合蛋白 | 缺席 |
26 | 脂聯素 | 26.1 | 激素（細胞因子） | 缺席 |
27 | 轉鐵蛋白前體 | 77.7 | 糖蛋白/主要抗氧化蛋白和保護精子免受凍融應激過程中的氧化損傷[ 69 ] | 缺席 |
28 | 間α-胰蛋白酶抑製劑重鏈1前體 | 101.2 | 絲氨酸蛋白酶抑製劑 | 缺席 |
29 | 角蛋白25 ，我喜歡 | 49.3 | 中間絲 | 缺席 |
三十 | 牛血紅蛋白鏈C. | 15 | 金屬蛋白酶 | 缺席 |
31 | 血紅蛋白 ，β | 16 | 珠蛋白 | 缺席 |
32 | 載脂蛋白N. | 28.5 | 脂蛋白 | 缺席 |
34 | 膠原蛋白 ，III型 ，α1 | 137.1 | 纖維硬蛋白 | 缺席 |
35 | 免疫球蛋白輕鏈 | 10.4 | 多肽 | 缺席 |
36 | α-2-巨球蛋白變體1 | 115.1 | 血漿蛋白/蛋白酶抑製劑和抗凋亡蛋白[ 86] | 缺席 |
37 | α-2-巨球蛋白變體4 | 42.3 | 血漿蛋白/蛋白酶抑製劑和抗凋亡蛋白[ 86] | 缺席 |
38 | Kininogen異構體X2 | 44.4 | 多肽 | 缺席 |
39 | 蛋白質變暗了 | 39.4 | 螺旋 - 環 - 螺旋蛋白 | 缺席 |
40 | 伯胺氧化酶 | 81.7 | 含銅酶/細胞生長和分化的生物調節劑 ，也通過改變膜參與細胞凋亡調控[ 78 ] | 缺席 |
41 | 肌動蛋白 ，α2 ，平滑肌 ，主動脈 | 39.3 | 球狀蛋白質 | 缺席 |
42 | 亞甲基四氫葉酸脫氫酶（NADP +依賴）1樣 | 81.6 | 連接酶 | 缺席 |
因為FBS富含幾種生長因子和蛋白質 ，所以它通常用作細胞和組織培養物的培養基補充劑 。FBS還用作非滲透性冷凍保護劑 ，用於冷凍保存幾種細胞類型 。高成本 ，道德問題以及傳播血液傳播疾病的可能性導致需要找到冷凍保存的替代品[ 22 ] 。迄今為止 ，許多血清替代已被引入用於細胞凍存[ 25 - 27 ]; 然而 ，它們的使用是有限的 ，主要是因為它們的高成本和采購困難 。在本研究中 ，尊龍凱時研究了BuOF是否可以替代FBS用於幾種不同細胞類型的冷凍保存 。
發現BuOF的生化組成與FBS的生化組成不同 。發現除LDL膽固醇和抗壞血酸外的所有成分在FBS中以更高的濃度存在（分別在BuOF中高約1.8倍和6.4倍; 表1） 。LDL膽固醇含有85-90％的脂類以及10-15％的蛋白質[ 37 ] ，並負責在凍融[凝膠化過程37 - 40 ] 。通過提供流體穩定性 ，BuOF中存在更高的LDL膽固醇含量可有利於細胞冷凍保存 。LDL膽固醇通過阻止精子細胞膜中磷脂和膽固醇的外流來保護精子細胞免受冷休克[ 41]] 。蛋黃 ，其中富含LDL膽固醇 ，已被證明是公牛精子的有效冷凍保存液[ 42 ，43 ] ，種馬[ 44 ] ，公羊[ 45 ] ，和狗[ 46 ] 。
抗壞血酸是一種微量營養素 ，可以防止細胞凋亡過程中發生的膜去極化和細胞色素C釋放事件[ 47] 。Lane 等人 。觀察到用抗壞血酸冷凍保存的小鼠胚胎中乳酸脫氫酶水平顯著降低[ 48 ] 。在BuOF中存在高濃度的抗壞血酸可以起到防止自由基損害的作用 ，這是在細胞冷凍期間或之後立即喪失生存能力的原因之一[ 49]] 。因此 ，在該研究中維持了不同細胞係的活力 。此外 ，BuOF中高濃度的抗壞血酸可能是細胞係中膜聯蛋白V表達和BAX / BCL2比例與在BuOF和FBS中冷凍保存的hPBMC的相似性的原因 。然而 ，目前尚不清楚該效果是否完全是由於抗壞血酸或BuOF中的一些其他成分。
膜聯蛋白V表達已被用於評估早期凋亡細胞[ 50 ] ，而BAX（促凋亡）與BCL2（抗凋亡）基因表達的比率表明冷凍保存細胞對細胞凋亡的易感性[ 51 ] 。之前的研究表明 ，膜聯蛋白V檢測可用於檢測凍融人類精子的膜完整性[ 52 ] 。此外 ，BAX / BCL2比率用於確定體外培養不同階段的胚胎和卵母細胞的質量[ 53]] 。在D10S20或D10O20除了mBMC和在D10中冷凍的細胞中冷凍保存的所有細胞類型中 ，相對膜聯蛋白V表達和BAX / BCL2比例相似 。這些發現表明 ，在本研究中冷凍保存的大多數細胞類型中 ，FBS和BuOF都具有相似的抑製細胞凋亡的能力 。盡管在D10O20中冷凍的小鼠初級懸浮細胞如mBMC中 ，BAX / BCL2比例與在D10中冷凍的細胞相似 。然而 ，在任一組中冷凍保存的mBMC中膜聯蛋白V的表達沒有差異 。這些發現表明 ，與BuOF不同 ，FBS有利於預防mBMCs的晚期凋亡 。有趣的是 ，兩種組中人原代細胞（hPBMCs）中膜聯蛋白V的表達和BAX / BCL2比例相似 。這些結果表明，與hPBMC不同 ，mBMC在冷凍保存期間對細胞凋亡非常敏感 。54 ，55 ] 。這可能解釋了小鼠原代細胞中BAX / BCL2比值的升高 。
從低溫儲存中回收活細胞是一個主要問題[ 56 ] 。最初 ，所有的細胞類型的活力解凍比較BuOF和FBS冷凍能力後 ，立即進行了估計 ，在早期的研究報道[ 26 ，27 ，57] 。盡管在解凍後立即在D10O20中冷凍的MEF細胞的存活率低 ，但培養細胞中膜聯蛋白V和BAX / BCL2比率的表達與在D10S20中冷凍的細胞沒有差異 。這些發現表明雖然BuOF不能保持最初的生存能力 ，但它可以防止凍融MEF細胞的早期和晚期凋亡 。相反 ，在D10中冷凍的所有細胞類型不僅在解凍後立即具有較低的細胞活力 ，而且在培養的細胞中具有升高的膜聯蛋白V和BAX / BCL2比率 。這些發現表明 ，在cryomedia中存在FBS或BuOF顯著增強細胞存活並防止細胞凋亡 。有趣的是 ，在D10中冷凍的少數培養的貼壁細胞如C18-4 ，HEK和mES細胞的細胞存活率與其他組中冷凍的細胞沒有差異 ，但這些細胞中膜聯蛋白V和BAX / BCL2的比例明顯較高 。這些結果表明僅僅恢複冷凍融化細胞的細胞活力不能成為冷凍保存培養基提供的冷凍保護的可靠指標[58 ]。評估冷凍融化細胞中凋亡特異性蛋白的表達也是必不可少的[ 59 ] 。由於不同細胞以不同的速率生長 ，培養後的細胞恢複是評估低溫保存後其生長速度的理想方法 。細胞的恢複可以通過細胞回收百分比[ 60 ]和增殖細胞特異性蛋白質如PCNA的表達來評估[ 61 ] 。冷凍解凍的鼠神經前體細胞保留了它們的增殖能力 ，如PCNA表達所示[ 62] 。在本研究中使用的所有細胞類型中 ，在單獨DMSO中冷凍的細胞中回收的細胞百分比和PCNA表達（D10）顯著低於用DMSO和FBS或BuOF冷凍的細胞 。這些發現進一步支持在低溫介質中使用FBS或BuOF進行細胞冷凍保存 。
然而 ，對於在D10O20中冷凍保存的MEF細胞 ，細胞恢複和PCNA表達顯著低於在D10S20中冷凍保存的細胞中的細胞 ，並且24小時後恢複的培養細胞的存活率與新鮮細胞和在D10S20中冷凍的細胞沒有差異 。這種差異可能是因為MEF細胞是原代細胞 ，並且在冷凍保存後需要超過24小時才能恢複細胞生長和增殖 。另一個合理的解釋可能是FBS中存在更高的蛋白質 ，脂蛋白和甘油三酯含量導致更好的冷凍保存MEF細胞。緩激肽[ 63 ] ，微管蛋白[ 64 ] ，熱休克蛋白90 [ 65 ]和超氧化物歧化酶[ 66]據報道，它們在公牛精子冷凍保存中發揮作用 。Enolase是一種金屬酶 ，可通過減少氧化應激和細胞毒性來代替DMSO ，從而在大鼠肝細胞的冷凍保存中取代[ 67 ] 。這些蛋白質僅在FBS中的存在可能提供優異的冷凍保護作用 。
盡管BuOF的蛋白質含量遠低於FBS的蛋白質含量 ，但是進行了BuOF和FBS的比較蛋白質組學分析以鑒定可能對冷凍保存至關重要的蛋白質/肽 。通過MS / MS分析在BuOF中鑒定出總共41種蛋白質 。大多數蛋白質是糖蛋白 ，球狀蛋白質和脂蛋白 。在41種鑒定的蛋白質中 ，16種也存在於FBS中（表2） 。先前在人類玻璃體液中報道了存在於FBS和BuOF中的轉運蛋白 ，如白蛋白 ，血清轉鐵蛋白 ，轉甲狀腺素蛋白和載脂蛋白AI [ 68 ] ，這證實了本研究中遵循的蛋白質組學方法 。
這些蛋白質在生物學上是必需的 ，在細胞穩態中具有重要作用 ，並且充當激素載體 。轉鐵蛋白在凍融脅迫期間保護精子免受氧化損傷[ 69 ] 。纖維連接蛋白是另一種在BuOF中發現的重要糖蛋白 ，在細胞 - 細胞聚集，細胞 - 基質粘附 ，細胞與細胞外基質成分的附著和細胞運動中起重要作用[ 70 ] 。凝溶膠蛋白是一種肌動蛋白絲 ，可以封閉和切斷提高細胞遷移速率的蛋白[ 71 ] ，參與細胞凋亡的控製和執行[ 72 ] 。這種溶血磷脂酸轉運蛋白被認為具有抗氧化特性[ 73] 。這些蛋白質在BuOF中的存在可能是冷凍保存細胞係中促凋亡蛋白質表達降低的原因 。
幾種蛋白水解酶與細胞凋亡和相關過程有關。BuOF中的α-1抗蛋白酶（A1P1）是絲氨酸蛋白酶抑製劑（serpin）[ 74 ] ，通過抑製caspase-3活性來調節細胞凋亡[ 75 ] 。發現在BuOF和FBS中鑒定的許多蛋白質參與脂質轉運和結合以及細胞遷移 。Transthyretin是一種BuOF中的轉運蛋白 ，參與脂質代謝[ 76 ] 。據報道載脂蛋白AI是高密度脂蛋白（HDL）的主要成分 ，可促進內皮細胞和血管平滑肌細胞的增殖並抑製細胞凋亡[ 77]] 。這些蛋白質在BuOF中的存在對於防止冷凍和解凍期間的細胞凋亡可能是至關重要的 。
一些蛋白質僅在BuOF中被鑒定出來 。胺氧化酶和激肽原報告在預防細胞凋亡[中發揮至關重要的作用78 ，79 ] 。肌動蛋白在細胞結構 ，運動和細胞分裂中起著至關重要的作用[ 77 ] 。肌動蛋白的損傷會在冷凍保護劑如丙二醇和DMSO的存在下改變微管組織[ 80 ] 。BuOF中存在的球狀和糖蛋白有助於重要的細胞功能 ，例如細胞分裂過程中細胞的遷移和收縮 。Regucalcin在許多細胞類型的細胞信號係統中具有抑製蛋白的作用[ 81] 。胎球蛋白（Fetuin）是一種糖蛋白和蛋白酶抑製劑 ，可增加超氧化物歧化酶和穀胱甘肽過氧化物酶的酶活性 ，從而最大限度地減少冷凍精液中的膜和DNA損傷[ 82 ] 。這些蛋白質是否在細胞冷凍保存中起關鍵作用需要進一步研究 。
這是一項初步研究 ，確定BuOF是冷凍保存培養基中FBS的替代品 。眼液的組成可隨著年齡 ，性別 ，品種 ，起源以及動物的生理和健康狀況而變化 。眼液組成的變化可能影響冷凍保存細胞的細胞存活和基因表達 。因此 ，在BuOF可以用於商業應用之前 ，需要進一步的研究和標準化 。
總之 ，本研究證明了粘附細胞係（如CHO ，HEK ，C18-4和mES細胞）和初級懸浮細胞（如20％BuOF中的hPBMC和mBMC）的有效低溫保存 ，以及其在低溫介質中替代FBS的潛力 。由於小鼠原代細胞（mBMC和MEF細胞）易受冷凍損傷影響 ，因此需要進一步研究使用BuOF進行冷凍保存 。BuOF的蛋白質組學和生物化學分析鑒定了可能在細胞冷凍保存中起關鍵作用的幾種組分 。進一步的研究闡明了BuOF在幾種不同細胞類型中的作用 ，可以幫助建立BuOF作為無血清冷凍保存方案的重要組成部分 。
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胎牛血清（FBS）的蛋白質組學分析 。
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